Kategoria: Badania

28.08.2023

Interferometria w spektroskopii w bliskiej podczerwieni

Optyka dyfuzyjna oferuje nieinwazyjne podejście do badania tkanek biologicznych, w tym ludzkiego mózgu in vivo [1]. Spektroskopia w bliskiej podczerwieni (NIRS) [2] i spektroskopia korelacyjna (DCS) są podstawowymi metodami optyki dyfuzyjnej [3, 4]. W obu podejściach światło oświetla tkankę, a rozproszone dyfuzyjnie fotony są zbierane w pewnej odległości od emitera (zwykle 2-3 cm). NIRS wykorzystuje wykryty sygnał do oszacowania właściwości optycznych (współczynnika absorpcji i zredukowanego współczynnika rozpraszania), podczas gdy DCS określa ilościowo przepływ krwi na podstawie czasowych zmian natężenia rejestrowanego światła. Chociaż metody te zostały zastosowane do monitorowania natlenienia mózgu i przepływu krwi, ich najczęściej stosowane wersje opierają się na laserach o ciągłej długości fali (CW), co wyklucza bezwzględne pomiary optycznych i dynamicznych właściwości tkanek [5].

NIRS w dziedzinie czasu (TD-NIRS) umożliwia kwantyfikację właściwości optycznych poprzez analizę rozkładu czasu przelotu fotonów w próbce (tak zwany rozkład czasu lotu, ang. time-of-flight, TOF) [9-12]. Zdolność tę można również połączyć ze spektroskopią korelacyjną w celu uzyskania informacji o przepływie krwi z rozdzielczością TOF (lub długością ścieżki fotonów). W ten sposób możemy lepiej odróżnić fotony przechodzące przez warstwy powierzchowne (krótkie TOF) od fotonów podróżujących w głąb mózgu (długie TOF). Ponadto, biorąc pod uwagę rozkład TOF, możemy oszacować właściwości optyczne w celu uzyskania bezwzględnego wskaźnika przepływu krwi (BFI), skutecznie łącząc możliwości TD-NIRS z DCS w jedną modalność. Takie podejście nazywa się spektroskopią korelacyjną w dziedzinie czasu (TD-DCS) [6, 7].

Interferometry in brain monitoring

Obraz: Zastosowanie interferometrii do monitorowania funkcji mózgu.

Chociaż TD-DCS jest skuteczną techniką stosowaną nawet w klinikach, opiera się ona tylko na natężeniu światła. Dlatego TD-DCS nie umożliwia wykrywania fazy optycznej [8]. Faza optyczna jest dostępna w interferometrycznej spektroskopii w bliskiej podczerwieni (ang. interferometric near-infrared spectroscopy, iNIRS) [9]. Technika iNIRS wykorzystuje interferometrię opartą na czasowo spójnym przestrajalnym laserze w celu osiągnięcia rozdzielczości TOF. W szczególności iNIRS uzupełnia konwencjonalną konfigurację NIRS o przestrajalne źródło światła i ramię referencyjne. Pole emitowane z próbki jest rekombinowane z polem referencyjnym. Częstotliwość dudnień sygnału koduje długości ścieżek fotonów (lub czasy przelotu). Krótkie ścieżki generują niższe częstotliwości dudnień niż długie ścieżki. W związku z tym rozkład czasu przelotu fotonów można uzyskać poprzez odwrotną transformację Fouriera zarejestrowanego sygnału (analogicznie jak w przypadku techniki OCT z laserem strojonym, ang. swept-source OCT). Jednak iNIRS dostarcza znacznie więcej informacji (w porównaniu z NIRS) dzięki dwuwymiarowej funkcji autokorelacji (ACF) reemitowanego pola optycznego. W iNIRS ACF jest mierzona jako funkcja opóźnienia czasowego z rozdzielczością TOF. Ten dwuwymiarowy pomiar (rysunek poniżej) koduje informacje o absorpcji, rozpraszaniu i indeksie przepływu krwi (BFI) w próbce.

iNIRS został zweryfikowany w fantomach tkanki biologicznej [9], mózgu myszy [10] i ludzkim mózgu in vivo [11]. Jednak oryginalny iNIRS (jak też DCS i TD-DCS) wykorzystuje światłowody jednomodowe do detekcji rozproszonego światła, wymagając czasów integracji 0,5-1 sekundy. Ten przedział czasowy jest zbyt długi, aby wykrywać szybkie zmiany przepływu krwi w ludzkim mózgu, które mogą być powiązane z sygnałami neuronowymi.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno zaproponowaliśmy równoległą interferometryczną spektroskopię w bliskiej podczerwieni (πNIRS). W πNIRS używamy światłowodów wielomodowych do zbierania rozproszonego światła i szybkiej, dwuwymiarowej kamery do rejestracji światła. Każdy piksel kamery działa efektywnie jako pojedynczy kanał iNIRS. Przetworzone sygnały z każdego piksela są więc uśredniane przestrzennie, aby skrócić całkowity czas integracji. Co więcej, detekcja interferometryczna zapewnia nam unikalną możliwość dostępu do zespolonej informacji (amplitudy i fazy) o świetle emitowanym z próbki, co przy ponad 8000 równoległych kanałów umożliwiło nam wykrycie mózgowego przepływu krwi przy czasie integracji wynoszącym zaledwie 10 ms (∼100x szybciej niż konwencjonalny iNIRS). Wykorzystaliśmy takie podejście do monitorowania pulsacyjnego przepływu krwi w ludzkim przedramieniu in vivo. Wykazaliśmy również, że podejście to może monitorować aktywację kory przedczołowej poprzez rejestrowanie zmian przepływu krwi w czole badanego podczas czytania nieznanego tekstu [12].

Tekst: dr habil. Dawid Borycki

Team:

dr habil. Dawid Borycki

dr Michał Dąbrowski

mgr inż. Klaudia Nowacka

Referencje:

  1. S. Samaei, P. Sawosz, M. Kacprzak, Z. Pastuszak, D. Borycki, and A. Liebert, „Time-domain diffuse correlation spectroscopy (TD-DCS) for noninvasive, depth-dependent blood flow quantification in human tissue in vivo,” Sci Rep 11, 1817 (2021).
  2. D. Borycki, O. Kholiqov, and V. J. Srinivasan, „Interferometric near-infrared spectroscopy directly quantifies optical field dynamics in turbid media,” Optica 3, 1471-1476 (2016).
  3. D. Borycki, O. Kholiqov, S. P. Chong, and V. J. Srinivasan, „Interferometric Near-Infrared Spectroscopy (iNIRS) for determination of optical and dynamical properties of turbid media,” Opt Express 24, 329-354 (2016).
  4. D. Borycki, O. Kholiqov, and V. J. Srinivasan, „Reflectance-mode interferometric near-infrared spectroscopy quantifies brain absorption, scattering, and blood flow index in vivo,” Opt Lett 42, 591-594 (2017).
  5. S. Samaei, K. Nowacka, A. Gerega, Z. Pastuszak, and D. Borycki, „Continuous-wave parallel interferometric near-infrared spectroscopy (CW piNIRS) with a fast two-dimensional camera,” Biomed Opt Express 13, 5753-5774 (2022).

     

16.08.2023

Nowy artykuł naukowców IDoc, zagranicznych badaczy i spółki spin-off opublikowany w magazynie „Biomedical Optics Express”

Optyczna tomografia koherencyjna (ang. optical coherence tomography, OCT) całego oka stanowi obiecujące narzędzie w biometrii oka do planowania operacji zaćmy, diagnozowania jaskry oraz badania postępu krótkowzroczności. Konwencjonalne systemy OCT są skonfigurowane do przeprowadzania skanów albo przedniego, albo tylnego segmentu oka i nie mogą łatwo przełączać się między tymi dwiema konfiguracjami skanowania bez dodawania lub wymiany komponentów optycznych, dopasowanych do toru optycznego oka. W niniejszej pracy przedstawiamy projekt, proces optymalizacji oraz eksperymentalną walidację rekonfigurowalnego i niskokosztowego optycznego skanera wiązki opartego na trzech soczewkach sterowanych elektrycznie, zdolnych do niemechanicznego sterowania położeniem, kątem i ogniskowaniem wiązki. Proponowane rozwiązanie jest prostsze i tańsze niż inne skanery całego oka i doskonale nadaje się do biometrii oka w 2D. Dodatkowo, dzięki wszechstronności płynnej rekonfiguracji skanowania, jego funkcjonalność można łatwo rozszerzyć na inne zastosowania okulistyczne i nie tylko.

Tekst: dr Andrea Curatolo – lider grupy IDoc w ICTER.

Tłumaczenie: mgr Maciej Wielgo – doktorant w grupie IDoc.

Publikacja:

María Pilar Urizar, Enrique Gambra, Alberto de Castro, Álvaro de la Peña, Onur Cetinkaya, Susana Marcos, and Andrea Curatolo, „Optical beam scanner with reconfigurable non-mechanical control of beam position, angle, and focus for low-cost whole-eye OCT imaging,” Biomed. Opt. Express 14, 4468-4484 (2023)

Link: https://opg.optica.org/boe/fulltext.cfm?uri=boe-14-9-4468&id=535917

22.06.2023

Mikrofluidyczne układy kroplowe

Mikrofluidyczne układy kroplowe pozwalają na manipulowanie małymi objętościami cieczy o dwóch niemieszających się fazach, np. wody i oleju. W efekcie powstaje mały reaktor, w którym można przeprowadzać i obserwować w czasie reakcję chemiczną lub proces biologiczny. Mikrokropelki mogą być mieszane, sortowane, inkubowane i analizowane. Operacje te mogą być wykonywane w specjalnie zaprojektowanych układach mikrofluidycznych, tworząc małe urządzenie typu „lab-on-a-chip”. Głównym celem naszych badań jest obserwacja zachowania klinicznie istotnych szczepów bakterii, w szczególności, jak reagują one na antybiotyki. Zastosowanie optyki i techniki laserowej w połączeniu z układami mikrofluidycznymi pozwala na znacznie szybsze przeprowadzanie eksperymentów.

Antybiotykooporność (antimicrobial resistance, AMR) jest jednym z najpilniejszych zagrożeń dla zdrowia na świecie. Występuje ona, gdy bakterie, wirusy, grzyby i pasożyty przekształcają się z czasem i nie reagują już na leki. W rezultacie antybiotyki lub inne leki przeciwdrobnoustrojowe stają się nieskuteczne i nie pozwalają leczyć chorób. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała AMR za jedno z 10 największych zagrożeń dla zdrowia publicznego na świecie.

Monitorowanie zachowania bakterii, tj. ich wzrostu, jest trudnym i czasochłonnym zadaniem, szczególnie gdy musimy śledzić tysiące lub miliony powtórzeń eksperymentów. Metody optyczne w połączeniu z mikrofluidyką pozwalają nam rozwiązać ten problem. Możemy przesuwać krople przed wiązką lasera i analizować światło rozproszone na komórkach bakterii za pomocą specjalnie zaprojektowanych chipów. Intensywność rozproszonego światła jest związana z koncentracją bakterii w kroplach, a my możemy śledzić ją w czasie. Możemy monitorować ponad 1000 kropli na sekundę i analizować je za pomocą dedykowanego oprogramowania. Dodatkowo, możemy również uczynić system bardziej kompaktowym i łatwiejszym w użyciu poprzez zastosowanie optyki światłowodowej, zaproponowaliśmy układ, w którym specjalnie dobrane włókno optyczne jest wykorzystywane do zbierania światła rozproszonego na bakteriach [1].

Z drugiej strony, poważne, nie gojące się infekcje są jednak często wywoływane przez wiele patogenów lub warianty genetyczne tego samego patogenu wykazujące różne poziomy oporności na antybiotyki. Przykładowo, polimikrobowe zakażenia stopy cukrzycowej podwajają ryzyko amputacji w porównaniu z zakażeniami monomikrobowymi. Chociaż infekcje te prowadzą do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności, standardowe metody oznaczania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe są zaprojektowane dla jednorodnych próbek i nie sprawdzają się w ilościowym określaniu heterooporności. Proponujemy opartą na kroplach metodę do ilościowego określania odpowiedzi antybiotykowej całej populacji na poziomie pojedynczej komórki. Wykorzystaliśmy próbki Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, aby potwierdzić, że możemy uzskać informacje o współistnieniu różnych subpopulacji bakterii, ich wielkości i heterooporności na antybiotyki [2].

Autor: dr Jakub Bogusławski

Zespół:

dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

dr Kamil Liżewski klizewski@ichf.edu.pl

Prof. Maciej Wojtkowski mwojtkowski@ichf.edu.pl

Publikacje:

  1. Natalia Pacocha, Jakub Bogusławski, Michał Horka, Karol Makuch, Kamil Liżewski, Maciej Wojtkowski, Piotr Garstecki, „High-Throughput Monitoring of Bacterial Cell Density in Nanoliter Droplets: Label-Free Detection of Unmodified Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria,” Analytical Chemistry (2020).
  2. Natalia Pacocha, Marta Zapotoczna, Karol Makuch, Jakub Bogusławski, Piotr Garstecki, “You will know by its tail: a method for quantification of heterogeneity of bacterial populations using single-cell MIC profiling,” Lab on a Chip 22, 4317-4326 (2022).
20.06.2023

Nieinwazyjna optoretinografia (ORG)

Od wielu lat okuliści wykorzystują wizualną kontrolę fotografii dna oka [1] oraz obrazów uzyskanych za pomocą optycznej tomografii koherencyjnej (ang. Optical Coherence Tomography – OCT) [2] do diagnozowania chorób oczu i monitorowania postępów terapii dzięki ich zdolności do wykrywania zmian morfologicznych w siatkówce oka. Jednak samo obrazowanie morfologicznych objawów chorób nie dostarcza wystarczających informacji na temat utraty funkcji fotoreceptorów.

Ponad dekadę temu wykazano, że optyczna tomografia koherencyjna może wykrywać niewielkie zmiany intensywności światła podczerwonego odbitego od siatkówek zwierzęcych in vitro [3,4] i in vivo [5] występujące po jednoczesnej stymulacji światłem widzialnym. Odkrycia te stworzyło podwaliny pod rozwój optoretinografii (ang. optoretinography – ORG) [6], metody, która mierzy odpowiedź siatkówki oka na światło, dając tym samym możliwość uzyskania informacji o działaniu neuronów siatkówki (fotoreceptorów).

W ICTER pracujemy nad rozwojem ORG ze stymulacją siatkówki pojedynczym impulsem światła, jak światłem migoczącym [7]. Aby uzyskać dane ORG, używamy tomografii STOC (ang. Spatio-Temporal Optical Coherence-Tomography) [8], która pozwala nam rejestrować trójwymiarowe objętościowe obrazy siatkówki w ciągu kilku milisekund. Po przetworzeniu danych wyodrębniamy sygnały ORG, śledząc zmiany w siatkówce zachodzące między błoną graniczną (ang. inner and outer photoreceptor junction – IS/OS) a końcówkami zewnętrznego segmentu czopków (ang. cone outer segment tips – COST). Rysunek (a) pokazuje lokalizację źródła sygnału ORG na tomograficznym obrazie siatkówki oka ludzkiego.

Przykładowe wyniki pokazujące odpowiedzi siatkówki zaadaptowanej do ciemności na pojedynczy impuls światła pokazano na rys. (b) i (c). Rysunek (b) przedstawia uśredniony przestrzennie sygnał ORG w funkcji czasu zarejestrowany dla równomiernie rozłożonego bodźca. Natomiast rys. (c) pokazuje maksymalną amplitudę sygnału ORG na obrazowanej części powierzchni siatkówki w odpowiedzi na stymulację wzorem zawierającym literę E.

W eksperymentach f-ORG (ang. Flicker ORG), które są główną tematyką naszych prac, do stymulacji siatkówki wykorzystywane jest migoczące światło. Po raz pierwszy takie badanie przeprowadzili Schmoll i wsp. i zmierzyli oni odpowiedź fotoreceptorów na migotanie o częstotliwości 5 Hz [9], W ostatnim czasie, natomiast grupa z Lübeck zmierzyła odpowiedź na różne częstotliwości migotania (od 1 Hz do 6,6 Hz) [10]. Nasza metodologia f-ORG pozwala na pomiar odpowiedzi siatkówki w szerszym zakresie częstotliwości i mapowanie odpowiedzi fotoreceptorów na migoczące światło na powierzchni siatkówki. Przykładowe wyniki zmierzonych charakterystyk częstotliwościowych odpowiedzi u czterech zdrowych osób przedstawiono na rys. (d). Natomiast przykład przestrzennie wykrytej odpowiedzi siatkówki na bodziec projektowany przy użyciu DMD z paskami światła migoczącymi z różnymi częstotliwościami przedstawiono na rys. (e).

Tekst: dr Sławomir Tomczewski, PhD,

Zespół:

dr Sławomir Tomczewski

mgr Piotr Węgrzyn

dr habil. Dawid Borycki

dr Egidijus Auksorius

mgr Maciej Wielgo

Prof. Maciej Wojtkowski

dr Andrea Curatolo

Słowa kluczowe: Optyczna Tomografia Koherencyjna, STOC-T, OCT, Optoretinografia, Migotanie, f-ORG.

Publikacje:

  1. V. J. Srinivasan, M. Wojtkowski, J. G. Fujimoto, and J. S. Duker, „In vivo measurement of retinal physiology with high-speed ultrahigh-resolution optical coherence tomography,” Opt. Lett. 31, 2308 (2006).
  2. S. Tomczewski, P. Węgrzyn, D. Borycki, E. Auksorius, M. Wojtkowski, and A. Curatolo, „Light-adapted flicker optoretinograms captured with a spatio-temporal optical coherence-tomography (STOC-T) system,” Biomed. Opt. Express 13, 2186 (2022).
  3. E. Auksorius, D. Borycki, P. Wegrzyn, B. L. Sikorski, K. Lizewski, I. Zickiene, M. Rapolu, K. Adomavicius, S. Tomczewski, and M. Wojtkowski, „Spatio-Temporal Optical Coherence Tomography provides full thickness imaging of the chorioretinal complex,” iScience 25, 105513 (2022).
15.06.2023

Skaningowy oftalmoskop laserowy z dwufotonowo pobudzaną fluorescencją (TPEF-SLO)

Zdolność do nieinwazyjnego dostępu do procesów metabolicznych podczas cyklu wzrokowego ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii przeciwko chorobom zwyrodnieniowym siatkówki. Opracowaliśmy protokół uzyskiwania in vivo obrazów fluorescencji wzbudzonego dwufotonowo dna oka ludzkiego.

Cykl widzenia to seria przemian chemicznych, podczas których powstają różne półprodukty fluorescencyjne. Autofluorescencja dna oka indukowana niebieskim światłem umożliwia obrazowanie fluoroforów siatkówki. Jednak ze względu na fundamentalne ograniczenia metoda ta ogranicza się do obrazowania lipofuscyn, które zawierają produkty uboczne cyklu wzrokowego, ale nie odzwierciedlają bezpośrednio zmian w funkcji fotoreceptorów. Widma absorpcyjne fluoroforów biorących udział w cyklu wdzenia, takich jak estry retinylu, mieszczą się w zakresie widmowym UV. Jednak absorpcja i rozpraszanie w przedniej części oka, a także względy bezpieczeństwa wykluczają promieniowanie UV z zastosowań w obrazowaniu okulistycznym.

Wzbudzenie dwufotonowe pozwala ominąć to ograniczenie i wzbudzić niedostępne wcześniej fluorofory, tworząc nowe możliwości diagnostyczne. Fluorofory siatkówki mogą być wzbudzane przy minimalnej absorpcji i znacznie niższym rozpraszaniu i fototoksyczności przy użyciu impulsów femtosekundowych o długości fal bliskiej podczerwieni. Wcześniej pokazaliśmy, że obrazowanie za pomocą skanującego oftalmoskopu laserowego z dwufotonowo-wzbudzaną absorpcją okazało się bardzo przydatne u myszy. Niedawno, w 2022 roku, po raz pierwszy zedemonstrowaliśmy obrazowanie oka ludzkiego in vivo przy użyciu dwufotonowo-wzbudzanej fluorescencji w bliskiej podczerwieni. Zbudowaliśmy kompaktowy instrument oparty na skaningowym oftalmoskopie laserowym (SLO) z niestandardowym femtosekundowym laserem światłowodowym i wydajną detekcją fotonów oraz zaprojektowaliśmy zaawansowane przetwarzanie danych, które umożliwiło pomiar sygnałów dwufotonowych na poziomie pojedynczych fotonów. W rezultacie możemy zwizualizować rozkład fluoroforów siatkówki przy ekspozycji znacznie poniżej granicy bezpieczeństwa dla ludzkiego oka.

Zmierzyliśmy dziesiątki ochotników, aby potwierdzić solidność techniki i rozszerzyliśmy konfigurację eksperymentalną o pracę z modelami mysimi w celu zbadania różnych chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem czy choroba Stargardta. Obrazowanie przeprowadzono w ciemnym pokoju bez wcześniejszej adaptacji do ciemności lub rozszerzenia źrenic. W większości przypadków udało nam się zarejestrować sygnał fluorescencyjny i zrekonstruować obraz siatkówki. Technika ta rozwiewa obawy dotyczące bezpieczeństwa, umożliwiając uzyskiwanie dobrej jakości obrazów przy niskiej ekspozycji oka na światło lasera. Potwierdziliśmy przydatność systemu do przyszłego zastosowania klinicznego tej metody obrazowania. Nasze wyniki stanowią istotny krok w kierunku funkcjonalnego obrazowania ludzkiego oka, które bezpośrednio odzwierciedla lokalne zmiany w funkcji siatkówki.

Tekst: dr Michał Dąbrowski

Figure 1: a Example TPEF images of the human retina with different spectra filter on PMT detector. b The same but for mice retina. c Comparison of fluorescence signal intensity for different spectra filter both for humans and several mice models. d FLIM images along with phasor plot representations.
Rysunek 1: a Przykładowe obrazy dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji dla siatkówki ludzkiej i różnych filtrów spektralnych na detektorze (fotopowielacz). b Analogiczne obrazy dla siatkówki mysiej. c Porównanie intensywności sygnału fluorescencji dla różnych filtrów spektralnych, dla ludzi i różnych modeli mysich. d Obrazy dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji w siatkówce mysiej, wraz z reprezentacją fazorową.

Zespół:

dr Michał Dąbrowski

dr Sławomir Tomczewski

dr Agata Kotulska

dr Marcin J. Marzejon

dr Jakub Bogusławski

Prof. Maciej Wojtkowski

Publikacje:

  1. G. Palczewska, J. Boguslawski, P. Stremplewski, Ł. Kornaszewski, J. Zhang, Z. Dong, X.-X. Liang, E. Gratton, A. Vogel, M. Wojtkowski, and K. Palczewski, Noninvasive two-photon optical biopsy of retinal fluorophores, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 117, 22532 (2020)
  2. D. Stachowiak, J. Bogusławski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, M. Wojtkowski, and G. Soboń, „Frequency-doubled femtosecond Er-doped fiber laser for two-photon excited fluorescence imaging, Biomed. Opt. Express 11, 4431 (2020)
  3. J. Boguslawski, G. Palczewska, S. Tomczewski, J. Milkiewicz, P.Kasprzycki, D. Stachowiak, K. Komar, M. J. Marzejon, B. L. Sikorski, A. Hudzikowski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, K. Karnowski, G. Soboń, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, In vivo imaginh of the human eye using a 2-photon-excited fluorescence scanning laser ophthalmoscope, JCI 132, 154218 (2022)
  4. J. Bogusławski, S. Tomczewski, M. Dąbrowski, K. Komar, J. Milkiewicz, G. Palczewska, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, In vivo imaging of the muna retina using a two-photon excited fluorescence ophthalmoscope, STAR Protocols 4, 102225 (2023)
  5. G. Palczewska, M. Wojtkowski, and K. Palczewski, From mouse to human: Accessing the biochemistry of vision in vivo by two-photon excitation, Prog. Retin. Eye Res. 93, 101170 (2023)
15.06.2023

Widzenie dwufotonowe

Wzrok jest zdolnością do odbierania bodźców z otaczającego nas otoczenia w postaci fal elektromagnetycznych od 400 nm do 780 nm, nazywanego zakresem światła widzialnego. Proces widzenia zaczyna się w momencie, gdy foton światła widzialnego zostanie zaabsorbowany przez pigment wzrokowy fotoreceptora w światłoczułej części oka – siatkówce. Absorpcja fotonu inicjuje szereg reakcji biochemicznych, w wyniku których światło jest zamienione na sygnał elektryczny, przetwarzany później w mózgu.

Widzenie dwufotonowe polega na tym, że człowiek widzi ultrakrótkie impulsy lasera z zakresu bliskiej podczerwieni na skutek nieliniowego procesu optycznego – absorpcji dwufotonowej zachodzącej w pigmentach wzrokowych. Aparat wzrokowy reaguje tak, jakby w fotoreceptorach został zaabsorbowany jeden foton światła, podczas gdy absorbowane są dwa fotony promieniowania podczerwonego o dwukrotnie niższej energii. Bodziec jest postrzegany przez obserwatora tak, jakby miał kolor odpowiadający około połowie długości fali pobudzającej wiązki lasera podczerwonego.

Widzenie dwufotonowe ma kilka ciekawych właściwości innych od „normalnego”, jednofotonowego widzenia. Po pierwsze zachodzi dla innego zakresu spektralnego: od około 800 nm do 1300 nm – dla tych długości fali wrażenie barwne zmienia się od barwy niebieskiej, poprzez zieloną, żółtą, aż do czerwieni. Po drugie jasność bodźca dwufotonowego zmienia się kwadratowo z mocą promieniowania optycznego, a więc światło rozproszone w oku nie będzie postrzegane. Jasność zależy również od zogniskowania wiązki na siatkówce obserwatora. Obserwowane bodźce są bardziej ostre i o lepszym kontraście niż w przypadku „normalnego”, jednofotonowego widzenia.

W Międzynarodowym Centrum Badań Oka badamy zjawisko widzenia dwufotonowego – poznajemy właściwości tego procesu i jako pierwsi na świecie opisujemy je. Szukamy również zastosowań tego zjawiska, zarówno w diagnostyce medycznej (np. mikroperymetria dwufotonowa), jak i systemach wizualizacji informacji.

Mikroperymetria dwufotonowa

Konwencjonalne podejście do badania pola widzenia opiera się na wyświetlaniu bodźców widzialnych w różnych miejscach siatkówki pacjenta i rejestracji jej/jego odpowiedzi. Niestety, dokładność i powtarzalność klasycznych metod badania pola widzenia jest ograniczona. Nie możemy jej użyć w przypadkach pacjentów z nieprzeziernością ośrodka optycznego oka (np. zaćma).

Odpowiedzią na powyższe wyzwania może być mikroperymetria dwufotonowa – nowa technika diagnostyczna wykorzystująca impulsowe wiązki podczerwone do pobudzania siatkówki oka osoby badanej. Takie bodźce są postrzegane w procesie widzenia dwufotonowego. Zastosowanie dwufotonowej percepcji do badania pola widzenia ma kilka zalet. W przeciwieństwie do światła widzialnego, promieniowanie podczerwone jest mniej rozpraszane na nieprzeziernościach ośrodka optycznego oka. Ponadto, widzenie dwufotonowe jest procesem nieliniowym, co powoduje o połowę mniejszy rozrzut wartości progu widzenia w porównaniu do klasycznej mikroperymetrii. To przekłada się na lepszą powtarzalność badania.

W Międzynarodowym Centrum Badań Oka badamy rozwijamy technikę mikroperymetrii dwufotonowej, między innymi badając wpływ różnych parametrów impulsowych źródeł laserowych – długości fali, długości impulsu i częstotliwości repetycji, na efektywność pobudzania siatkówki.

Autorzy: dr Katarzyna Komar i dr Marcin Marzejon

Zespół:

dr Katarzyna Komar

dr Marcin Marzejon

mgr Oliwia Kaczkoś

dr Agata Kotulska

Prof. Maciej Wojtkowski

Publikacje:

  1. G. Palczewska, F. Vinberg, P. Stremplewski, M. P. Bircher, D. Salom, K. Komar, J. Zhang, M. Cascella, M. Wojtkowski, V. J. Kefalov, and K. Palczewski, “Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(50), E5445–E5454 (2014).
  2. D. Ruminski, G. Palczewska, M. Nowakowski, V. Kefalov, K. Komar, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, “Two-photon microperimetry: sensitivity of human photoreceptors to infrared light,” Biomed. Opt. Express 10(9), 4551–4567 (2019).
  3. G. Łabuz, A. Rayamajhi, J. Usinger, K. Komar, P. Merz, R. Khoramnia, G. Palczewska, K. Palczewski, and G. U. Auffarth, “Clinical application of infrared-light microperimetry in the assessment of scotopic-eye sensitivity,” Transl. Vis. Sci. Technol. 9(8), 1–9 (2020).
  4. M. J. Marzejon, Ł. Kornaszewski, J. Bogusławski, P. Ciąćka, M. Martynow, G. Palczewska, S. Maćkowski, K. Palczewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Two-photon microperimetry with picosecond pulses,” Biomed. Opt. Express 12(1), 462–479 (2021).
  5. M. Marzejon, Ł. Kornaszewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Effects of laser pulse duration in two-photon vision threshold measurements,” in Ophthalmic Technologies XXXI, D. X. Hammer, K. M. Joos, and D. V Palanker, eds. (SPIE, 2021), 11623, pp. 74–79.
  6. G. Łabuz, A. Rayamajhi, R. Khoramnia, G. Palczewska, K. Palczewski, A. Holschbach, and G. U. Auffarth, “The loss of infrared-light sensitivity of photoreceptor cells measured with two-photon excitation as an indicator of diabetic retinopathy: A pilot study,” Retina 41(6), 1302–1308 (2021).
  7. D. Stachowiak, M. Marzejon, J. Bogusławski, Z. Łaszczych, K. Komar, M. Wojtkowski, and G. Soboń, “Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomed. Opt. Express 13(4), 1899–1911 (2022).
  8. A. Zielińska, P. Ciąćka, M. Szkulmowski, and K. Komar, „Pupillary Light Reflex Induced by Two-Photon Vision,” Investig. Opthalmology Vis. Sci. 62(15), 23 (2021).
  9. M. J. Marzejon, “Two-photon perimetry utilizing picosecond lasers,” Gdańsk University of Technology (2022).
  10. O. Kaczkoś, A. Zielińska, M. J. Marzejon, J. Solarz-Niesłuchowski, J. Pniewski, K. Komar, “Methods of determining the contrast sensitivity function for two-photon vision,” Proc. SPIE 12502, 1250215 (2022).
  11. G. Łabuz, A. Rayamajhi, K. Komar, R. Khoramnia, and G. U. Auffarth, “Infrared- and white-light retinal sensitivity in glaucomatous neuropathy,” Sci. Rep. 12(1), 1961 (2022).
  12. M. J. Marzejon, PhD thesis “Two-photon perimetry utilizing picosecond lasers”, Gdańsk University of Technology (2022).
  13. D. Stachowiak, M. Marzejon, J. Bogusławski, Z. Łaszczych, K. Komar, M. Wojtkowski, and G. Soboń, “Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomed. Opt. Express 13(4), 1899–1911 (2022).
  14. M. J. Marzejon, Ł. Kornaszewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Laser pulse train parameters determine the brightness of a two-photon stimulus”,  Biomed. Opt. Express 14(4), 2857-2872 (2023).

09.06.2023

Dwufotonowa biopsja optyczna siatkówki oka

Siatkówka jest istotną częścią oka, ponieważ jest odpowiedzialna za przekształcanie światła w sygnały elektryczne, które są później przetwarzane w mózgu. Działa jak biologiczny fotodetektor. Obrazowanie struktury i funkcji żywej siatkówki ma kluczowe znaczenie dla skutecznego diagnozowania i leczenia chorób oczu oraz opracowywania leków. Informacje strukturalne o siatkówce można uzyskać m.in. dzięki badaniom OCT. Jednakże, zmiany funkcjonalne są pierwszymi oznakami wczesnych procesów patologicznych i często poprzedzają zmiany strukturalne; uzyskanie tych informacji jest obecnie bardzo trudne. Naukowcy z ICTER pracują nad nową metodą funkcjonalnego obrazowania dna oka, bazując na dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji.

Siatkówka ma strukturę warstwową, która jest wypełniona różnymi fluoroforami. Na przykład, nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) zawiera lipofuscynę, produkt uboczny cyklu widzenia. Lipofuscyna gromadzi się z wiekiem, ale także wraz z postępem choroby. Inne przykłady to retinol i estry retinylowe (pochodne witaminy A aktywne w cyklu wzrokowym), melanina, FAD, NADH, kolagen i elastyna. Substancje te mogą dostarczyć cennych informacji o stanie zdrowia siatkówki i mogą być cennym narzędziem do wykrywania zmian funkcjonalnych w przebiegu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej lub jaskry.

Standardowe obrazowanie autofluorescencji oka wizualizuje rozkład fluoroforów siatkówki, ale dostępna jest tylko informacja o intensywności. W rezultacie sygnały pochodzące od różnych fluoroforów nie mogą być rozróżnione. Lipofuscyna jest dominującym fluoroforem, a jej silny sygnał miesza się z innymi, pochodzącymi zwykle z znacznie słabszych źródeł. Różne fluorofory różnią się właściwościami fluorescencji, tj. czasem życia fluorescencji i widmem fluorescencji. Stanowi to dodatkowy parametr dyskryminacyjny, który pozwala je od siebie odróżnić.

Oko jest oknem na świat, ale ma też określony zakres transmisji. W związku z tym, wiele fluoroforów o widmach wzbudzenia w zakresie UV/niebieskim (<420 nm) nie może być wzbudzonych, a informacja w nich zawarta jest niedostępna. Naszym rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie wzbudzenia dwufotonowego. Schemat ten wykorzystuje krótkie (femtosekundowe) impulsy w bliskiej podczerwieni (dwukrotna długość fali), co pozwala ominąć ograniczenia wynikające z transmisji oka. Przykładowo, użycie impulsów femtosekundowych o długości fali 730 nm jest równoważne wzbudzeniu jednofotonowemu o długości fali 365 nm, co nie byłoby możliwe w żywym oku. Dodatkowe zalety tej metody to lepsza rozdzielczość, mniejsza fototoksyczność i mniejsze rozpraszanie.

W naszych badaniach dążymy do wizualizacji struktury i składu molekularnego tkanek oka, wykorzystując zarówno dyskryminację spektralną, jak i czasową. Przykładowo, obraz poniżej przedstawia rozkład czasu życia fluorescencji (FLIM) komórek nabłonka pigmentu siatkówki myszy Abca4PV/PV (model choroby Stargardta u ludzi). Obraz odzwierciedla różnice w subkomórkowej dystrybucji endogennych fluoroforów w nabłonku barwnikowym. Krótsze czasy życia (kolor niebiesko-zielony) są związane z A2E, składnikiem lipofuscyny. Czerwone granulki (dłuższy czas życia) mogą być związane z estrami retinylowymi.

Autor: dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

Zespół: Grażyna Palczewska, Jakub Bogusławski, Łukasz Kornaszewski, Maciej Wojtkowski

Publikacja:

Grazyna Palczewska, Jakub Boguslawski, Patrycjusz Stremplewski, Lukasz Kornaszewski, Jianye Zhang, Zhiqian Dong, Xiao-Xuan Liang, Enrico Gratton, Alfred Vogel, Maciej Wojtkowski, Krzysztof Palczewski, “Noninvasive two-photon optical biopsy of retinal fluorophores,” Proceedings of the National Academy of Sciences 117(36), 22532-22543 (2020).

02.06.2023

Laser światłowodowy domieszkowany Erbem

Lasery femtosekundowe są stosowane w wielu technikach stosowanych w biofotonice, m.in. w skaningowej mikroskopii wielofotonowej, dwufotonowej oftalmoskopii fluorescencyjnej i dwufotonowej mikroperymetrii. Metody te wymagają precyzyjnie dobranych parametrów ultrakrótkich impulsów, aby zapewnić nieinwazyjne i wydajne obrazowanie badanej próbki bądź badanie pacjenta. Obecnie najczęściej w tym celu stosowane są lasery tytanowo-szafirowe lub oscylatory parametryczne, jednak tego typu źródła są bardzo kosztowne, skomplikowane w użyciu, wymagają chłodzenia wodą oraz nie są mobilne. Rozwiązaniem tych problemów może być użycie femtosekundowych laserów światłowodowych, które oferują równie krótki czas trwania impulsu, ale są znacznie bardziej kompaktowe, łatwiejsze w użyciu i transporcie, umożliwiając translację kliniczną. Laser opracowywane są na Politechnice Wrocławskiej, a naukowcy z ICTER pracują nad ich zastosowaniami.

Pierwszym z zastosowań jest mikroskopia wielofotonowa, a w szczególności mikroskopia fluorescencyjna ze wzbudzeniem dwufotonowym. W tej aplikacji kluczowa jest minimalizacja średniej mocy wzbudzającej lasera, co pozwala na zmniejszenie oddziaływania termicznego z badaną próbką. W tym celu opracowany został femtosekundowy laser światłowodowy z regulowaną częstotliwością repetycji i bardzo krótkim czasem trwania impulsu (poniżej 60 fs). Laser pracuje w zakresie spektralnym bliskiej podczerwieni (około 780 nm), poprzez podwojenie częstotliwości lasera domieszkowanego jonami erbu (pracującego na 1560 nm). Laser został opracowany w formie kompaktowego, łatwego w obsłudze prototypu [1].

Drugie zastosowanie, z zakresu okulistyki, to dwufotonowa oftalmoskopia fluorescencyjna. Jest to metoda pozwalająca na nieinwazyjne obrazowanie autofluorescencji wzbudzanej w siatkówce i warstwie nabłonka barwnikowego. W tej aplikacji kluczowe jest zmniejszenie mocy średniej wiązki lasera użytej do wzbudzania fluorescencji. Osiągnęliśmy to dzięki zastosowaniu femtosekundowego lasera światłowodowego z regulowaną częstotliwością repetycji oraz bardzo krótkim czasem trwania impulsu [2].

Ostatnie zastosowanie, również z zakresu okulistyki, to mikroperymetria dwufotonowa i badanie zjawiska widzenia dwufotonowego. Do tego celu został opracowany kolejny femtosekundowy laser światłowodowy z przestrajalną długością fali, w zakresie od 872 do 1075 nm. Tak szeroki zakres strojenia pozwolił na lepsze zbadanie skotopowej czułości spektralnej widzenia dwufotonowego u ludzi [3].

Zespół:

dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

dr Marcin Marzejon mmarzejon@ichf.edu.pl

dr Katarzyna Komar kkomar@ichf.edu.pl

Prof. Maciej Wojtkowski mwojtkowski@ichf.edu.pl

Publikacje:

  1. D. Stachowiak, J. Bogusławski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, M. Wojtkowski, G. Soboń, „Frequency-doubled femtosecond Er-doped fiber laser for two-photon excited fluorescence imaging,” Biomedical Optics Express 11(8), 4431 (2020).
  2. Jakub Boguslawski, Grazyna Palczewska, Slawomir Tomczewski, Jadwiga Milkiewicz, Piotr Kasprzycki, Dorota Stachowiak, Katarzyna Komar, Marcin J Marzejon, Bartosz L Sikorski, Arkadiusz Hudzikowski, Aleksander Głuszek, Zbigniew Łaszczych, Karol Karnowski, Grzegorz Soboń, Krzysztof Palczewski, Maciej Wojtkowski, „In vivo imaging of the human eye using a two-photon excited fluorescence scanning laser ophthalmoscope,” The Journal of Clinical Investigation 2022;132(2):e154218.
  3. Dorota Stachowiak, Marcin Marzejon, Jakub Bogusławski, Zbigniew Łaszczych, Katarzyna Komar, Maciej Wojtkowski, Grzegorz Soboń, „Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomedical Optics Express 131(4), 1899-1911 (2022).