Lasery femtosekundowe są stosowane w wielu technikach stosowanych w biofotonice, m.in. w skaningowej mikroskopii wielofotonowej, dwufotonowej oftalmoskopii fluorescencyjnej i dwufotonowej mikroperymetrii. Metody te wymagają precyzyjnie dobranych parametrów ultrakrótkich impulsów, aby zapewnić nieinwazyjne i wydajne obrazowanie badanej próbki bądź badanie pacjenta. Obecnie najczęściej w tym celu stosowane są lasery tytanowo-szafirowe lub oscylatory parametryczne, jednak tego typu źródła są bardzo kosztowne, skomplikowane w użyciu, wymagają chłodzenia wodą oraz nie są mobilne. Rozwiązaniem tych problemów może być użycie femtosekundowych laserów światłowodowych, które oferują równie krótki czas trwania impulsu, ale są znacznie bardziej kompaktowe, łatwiejsze w użyciu i transporcie, umożliwiając translację kliniczną. Laser opracowywane są na Politechnice Wrocławskiej, a naukowcy z ICTER pracują nad ich zastosowaniami.

Pierwszym z zastosowań jest mikroskopia wielofotonowa, a w szczególności mikroskopia fluorescencyjna ze wzbudzeniem dwufotonowym. W tej aplikacji kluczowa jest minimalizacja średniej mocy wzbudzającej lasera, co pozwala na zmniejszenie oddziaływania termicznego z badaną próbką. W tym celu opracowany został femtosekundowy laser światłowodowy z regulowaną częstotliwością repetycji i bardzo krótkim czasem trwania impulsu (poniżej 60 fs). Laser pracuje w zakresie spektralnym bliskiej podczerwieni (około 780 nm), poprzez podwojenie częstotliwości lasera domieszkowanego jonami erbu (pracującego na 1560 nm). Laser został opracowany w formie kompaktowego, łatwego w obsłudze prototypu [1].

Drugie zastosowanie, z zakresu okulistyki, to dwufotonowa oftalmoskopia fluorescencyjna. Jest to metoda pozwalająca na nieinwazyjne obrazowanie autofluorescencji wzbudzanej w siatkówce i warstwie nabłonka barwnikowego. W tej aplikacji kluczowe jest zmniejszenie mocy średniej wiązki lasera użytej do wzbudzania fluorescencji. Osiągnęliśmy to dzięki zastosowaniu femtosekundowego lasera światłowodowego z regulowaną częstotliwością repetycji oraz bardzo krótkim czasem trwania impulsu [2].

Ostatnie zastosowanie, również z zakresu okulistyki, to mikroperymetria dwufotonowa i badanie zjawiska widzenia dwufotonowego. Do tego celu został opracowany kolejny femtosekundowy laser światłowodowy z przestrajalną długością fali, w zakresie od 872 do 1075 nm. Tak szeroki zakres strojenia pozwolił na lepsze zbadanie skotopowej czułości spektralnej widzenia dwufotonowego u ludzi [3].

Zespół:

dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

dr Marcin Marzejon mmarzejon@ichf.edu.pl

dr Katarzyna Komar kkomar@ichf.edu.pl

Prof. Maciej Wojtkowski mwojtkowski@ichf.edu.pl

Publikacje:

1. D. Stachowiak, J. Bogusławski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, M. Wojtkowski, G. Soboń, „Frequency-doubled femtosecond Er-doped fiber laser for two-photon excited fluorescence imaging,” Biomedical Optics Express 11(8), 4431 (2020).
2. Jakub Boguslawski, Grazyna Palczewska, Slawomir Tomczewski, Jadwiga Milkiewicz, Piotr Kasprzycki, Dorota Stachowiak, Katarzyna Komar, Marcin J Marzejon, Bartosz L Sikorski, Arkadiusz Hudzikowski, Aleksander Głuszek, Zbigniew Łaszczych, Karol Karnowski, Grzegorz Soboń, Krzysztof Palczewski, Maciej Wojtkowski, „In vivo imaging of the human eye using a two-photon excited fluorescence scanning laser ophthalmoscope,” The Journal of Clinical Investigation 2022;132(2):e154218.
3. Dorota Stachowiak, Marcin Marzejon, Jakub Bogusławski, Zbigniew Łaszczych, Katarzyna Komar, Maciej Wojtkowski, Grzegorz Soboń, „Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomedical Optics Express 131(4), 1899-1911 (2022).

Projekt „Two photon vision and two photon eye imaging (2×2-PhotonVis)” był realizowany w ramach IChF PAN, a następnie ICTER od grudnia 2017 do września 2022 roku. Głównym celem projektu było opracowanie nowatorskich i oryginalnych metod optycznych oraz oprzyrządowania do badań funkcjonalnych wzroku ludzi i zwierząt, z wykorzystaniem procesów absorpcji dwufotonowej i fluorescencji wzbudzonej dwufotonowo. Projekt poszerzył naszą wiedzę na temat właściwości optycznych siatkówki ludzkiej i gryzoni oraz jej podatności na nieliniowe procesy optyczne dwufotonowej izomeryzacji chromoforów rodopsyny i dwufotonowo wzbudzonej fluorescencji w komórkach RPE. Efektem projektu było dziewięć prac opublikowanych w czasopismach indeksowanych przez JCR.

Projekt POIR.04.04.00-00-3D47/16 jest realizowany w ramach programu TAEM TECH Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego ze środków UE pochodzących z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Inteligentny Rozwój.

Autor tekstu: Dr. Slawomir Tomczewski
Lider projektu: Prof. Maciej Wojtkowski
Strona www projektu: https://2photon.icter.pl/

Powiązana publikacja: JCI Insight – Two-photon imaging of the mammalian retina with ultrafast pulsing laser

Two-photon imaging of the mammalian retina with ultrafast pulsing laser

• Tekst
• PDF

Abstract

Noninvasive imaging of visual system components in vivo is critical for understanding the causal mechanisms of retinal diseases and for developing therapies for their treatment. However, ultraviolet light needed to excite endogenous fluorophores that participate in metabolic processes of the retina is highly attenuated by the anterior segment of the human eye. In contrast, 2-photon excitation fluorescence imaging with pulsed infrared light overcomes this obstacle. Reducing retinal exposure to laser radiation remains a major barrier in advancing this technology to studies in humans. To increase fluorescence intensity and reduce the requisite laser power, we modulated ultrashort laser pulses with high-order dispersion compensation and applied sensorless adaptive optics and custom image recovery software and observed an over 300% increase in fluorescence of endogenous retinal fluorophores when laser pulses were shortened from 75 fs to 20 fs. No functional or structural changes to the retina were detected after exposure to 2-photon excitation imaging light with 20-fs pulses. Moreover, wide bandwidth associated with short pulses enables excitation of multiple fluorophores with different absorption spectra and thus can provide information about their relative changes and intracellular distribution. These data constitute a substantial advancement for safe 2-photon fluorescence imaging of the human eye.

Autorzy:

Grazyna Palczewska, Patrycjusz Stremplewski, Susie Suh, Nathan Alexander, David Salom, Zhiqian Dong, Daniel Ruminski, Elliot H. Choi, Avery E. Sears, Timothy S. Kern, Maciej Wojtkowski, Krzysztof Palczewski

Mikroperymetria jest subiektywną metodą badania pola widzenia, która umożliwia ocenę funkcji siatkówki w różnych jej miejscach. Mikroperymetria dwufotonowa jest rozwinięciem tej techniki. W przeciwieństwie do tradycyjnej mikroperymetrii, która wykorzystuje bodziec widzialny, mikroperymetria dwufotonowa wykorzystuje impulsowe lasery podczerwone jako źródło promieniowania optycznego. Osoba badana postrzega taki bodziec jako kolorowy dzięki zjawisku widzenia dwufotonowego [1].

Możliwość zastosowania mikroperymetrii dwufotonowej zależy w dużej mierze od parametrów lasera użytego do eksperymentów. Dlatego w ICTER prowadzimy szeroko zakrojone badania nad wpływem parametrów impulsowego lasera podczerwonego, takich jak: czas trwania impulsu, częstotliwość powtarzania impulsów, długość fali, na percepcję przez człowieka [2, 3]. Ponadto, prowadzimy kliniczną ocenę przydatności mikroperymetrii dwufotonowej do wcześniejszego i skuteczniejszego wykrywania zaburzeń funkcji wzrokowych oka [4]. Wierzymy, że głębsze zrozumienie zjawiska widzenia dwufotonowego, optymalizacja procedur badania pola widzenia oraz testy kliniczne pozwolą nam na dostarczenie użytecznego narzędzia dla okulistów na całym świecie.

Tekst: mgr inż. Marcin Marzejon

mmarzejon@ichf.edu.pl

[1] Ruminski et al., BOE 10(9), pp. 4551-4567 (2019). DOI: 10.1364/BOE.10.004551

[2] Marzejon et al., BOE 12(2), pp. 462-479 (2021). DOI: 10.1364/BOE.411168

[3] Marzejon et al., Proc. SPIE 11623, 116231N (2021). DOI: 10.1117/12.2582735

[4] Komar et al., AOVS 62(8), 2009 (2021)

Mikroperymetria dwufotonowa z impulsami pikosekundowymi

Marcin J. Marzejon, Łukasz Kornaszewski, Jakub Bogusławski, Piotr Ciąćka, Miłosz Martynow, Grażyna Palczewska, Sebastian Maćkowski, Krzysztof Palczewski, Maciej Wojtkowski & Katarzyna Komar

Abstract

Two-photon vision is a phenomenon associated with the perception of short pulses of near-infrared radiation (900-1200 nm) as a visible light. It is caused by the nonlinear process of two-photon absorption by visual pigments. Here we present results showing the influence of pulse duration and repetition rate of short pulsed lasers on the visual threshold. We compared two-photon sensitivity maps of the retina obtained for subjects with normal vision using a cost-effective fiber laser (λc = 1028.4 nm, τp = 12.2 ps, Frep = 19.17 MHz) and a solid-state laser (λc = 1043.3 nm, τp = 0.253 ps, Frep = 62.65 MHz). We have shown that in accordance with the description of two-photon absorption, the average optical power required for two-photon vision for a fiber laser is 4 times greater than that for a solid-state laser. Mean sensitivity measured for the first one is 5.9 ± 2.8 dB lower than for the second but still 17 dB away from the safety limit, confirming that picosecond light sources can be successfully applied in microperimetry. This development would dramatically reduce the cost and complexity of future clinical devices.

Link do publikacji

https://doi.org/10.1364/BOE.411168