04.09.2023

ICTER: Rozjaśniamy Życie (wideo o działalności Międzynarodowego Centrum Badań Oka)

Naukowcy z International Centre for Translational Eye Research (ICTER) podjęli wyzwanie stworzenia technologii diagnostycznej, która może okazać się fundamentalna dla zrozumienia chorób oczu. Ich rozwiązanie pomoże w szybkim diagnozowaniu takich schorzeń jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), wrodzona ślepota, retinopatia cukrzycowa czy niedrożność naczyń siatkówki.

Zespół naukowców z ICTER wprowadził nową metodę obrazowania funkcjonalnego zwaną optoretinografią opartą na migotaniu (ORG). Dzięki tej technice rejestrowane są nanometrowe zmiany długości fotoreceptorów związane z procesem widzenia. Technologia wykorzystywana przez naukowcóww z ICTER do pomiarów ORG to Spatio-Temporal Optical Coherence Tomography (STOC-T).

ORG umożliwi okulistom diagnozowanie chorób znacznie szybciej i skuteczniej niż obecnie. Co najważniejsze, badanie z udziałem pacjenta zajmie zaledwie jedną setną sekundy.

———————————————————————————————————————————————————

Realizacja filmu: agencja nFinity

Reżyser: Radek Furmanek

Scenariusz i tytuł filmu: dr n. med. Piotr Chaniecki

Animacja: Ramona Visuals

Specjalny udział gościnny w filmie: Prof. Olaf Strauss

Koordynacja naukowa: dr Karol Karnowski

Optymalizacja: Anna Salamończyk

Koordynacja projektu: Anna Przybyło-Józefowicz

Wsparcie: Zespół PR ICTER

———————————————————————————————————————————————————

Dziękujemy wszystkim pracownikom ICTER za ich zaangażowanie w proces powstawania filmu.

16.08.2023

Nowy artykuł naukowców IDoc, zagranicznych badaczy i spółki spin-off opublikowany w magazynie „Biomedical Optics Express”

Optyczna tomografia koherencyjna (ang. optical coherence tomography, OCT) całego oka stanowi obiecujące narzędzie w biometrii oka do planowania operacji zaćmy, diagnozowania jaskry oraz badania postępu krótkowzroczności. Konwencjonalne systemy OCT są skonfigurowane do przeprowadzania skanów albo przedniego, albo tylnego segmentu oka i nie mogą łatwo przełączać się między tymi dwiema konfiguracjami skanowania bez dodawania lub wymiany komponentów optycznych, dopasowanych do toru optycznego oka. W niniejszej pracy przedstawiamy projekt, proces optymalizacji oraz eksperymentalną walidację rekonfigurowalnego i niskokosztowego optycznego skanera wiązki opartego na trzech soczewkach sterowanych elektrycznie, zdolnych do niemechanicznego sterowania położeniem, kątem i ogniskowaniem wiązki. Proponowane rozwiązanie jest prostsze i tańsze niż inne skanery całego oka i doskonale nadaje się do biometrii oka w 2D. Dodatkowo, dzięki wszechstronności płynnej rekonfiguracji skanowania, jego funkcjonalność można łatwo rozszerzyć na inne zastosowania okulistyczne i nie tylko.

Tekst: dr Andrea Curatolo – lider grupy IDoc w ICTER.

Tłumaczenie: mgr Maciej Wielgo – doktorant w grupie IDoc.

Publikacja:

María Pilar Urizar, Enrique Gambra, Alberto de Castro, Álvaro de la Peña, Onur Cetinkaya, Susana Marcos, and Andrea Curatolo, „Optical beam scanner with reconfigurable non-mechanical control of beam position, angle, and focus for low-cost whole-eye OCT imaging,” Biomed. Opt. Express 14, 4468-4484 (2023)

Link: https://opg.optica.org/boe/fulltext.cfm?uri=boe-14-9-4468&id=535917

23.06.2023

„Badania wykonywane w ICTER to nie sztuka dla sztuki. One ulepszają okulistykę i ratują pacjentów” – wywiad z dr Piotrem Chanieckim, okulistą chirurgiem

Okulistyka jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin medycyny. Nie byłoby to możliwe bez ulepszania istniejących procedur i opracowywania zupełnie nowych metod leczenia oczu. O tym, jak ważny jest stały rozwój technik okulistycznych, rozmawiamy z dr Piotrem Chanieckim.

Co dla Pana  jest najważniejsze w okulistyce?

PCh: Okulistyka potrzebuje technologii. Największy postęp tej dziedziny nastąpił dopiero po rozwoju urządzeń diagnostycznych i technik operacyjnych. Na precyzję wykonywanych zabiegów i skuteczność diagnostyki bezpośredni wpływa poziom i zaawansowanie technologiczne. Międzynarodowe Centrum Badań Oka (ICTER) nastawione jest na rozwój takich urządzeń, Widzę w tym ogromny potencjał w tworzeniu nowych narzędzi dla lekarzy, które wpłyną na lepsze i szybsze diagnozy.

Polska okulistyka rozwija się dynamicznie, ale wciąż daleko nam do stopnia zaawansowania technologicznego, obecnego np. w zachodnich klinikach. Jaki jest powód, że w Polsce nie wykonuje się wielu specjalistycznych badań, mogących pomóc pacjentom.

Przed nami jeszcze wiele do zrobienia. Nie brakuje nam specjalistów, sam mam powód do dumy, ponieważ pod moim okiem wyszkoliło się kilku okulistów, chirurgów oraz diagnostów, którzy  jako samodzielni  i świetni lekarze pracują  na najlepszym sprzęcie, w polskich klinikach. W Polsce obserwuję pewnego rodzaju rozwarstwienie, są miejsca oferujące diagnostykę i leczenie na najwyższym światowym poziomie a także miejsca, które wymagają znacznego doinwestowania. Problemem są oczywiście pieniądze, ale nie tylko – w polskich placówkach jest wiele sprzętu, który nie  zawsze jest w pełni wykorzystywany. Jaka jest tego przyczyna? Mogę tylko przypuszczać, że chodzi o brak pomysłu do jakich badań sprzęt może zostać użyty, a może chodzi o trwanie w utartych procedurach i schematach.  To, co zauważam czasami w rozmowach z lekarzami, w tym pracującymi na uczelniach, to niechęć do zmian i podważania status quo – jeżeli jakaś metoda diagnostyczna działa, to po co ją zmieniać? Jeżeli ze średniej jakości wyników możemy postawić diagnozę, to dlaczego pocić się i męczyć, aby osiągnąć coś więcej.

Do tego dochodzi cały system szkolenia lekarzy, który wymaga wielu zmian. Osobiście nie zgadzam się z takim podejściem, między innymi dlatego zdecydowałem się na współpracę z ICTER, z której może wyniknąć wiele dobrego dla pacjentów.

dr Piotr Chaniecki

Jaki sprzęt tworzony w ICTER uważa Pan za najważniejszy z klinicznego punktu widzenia?

W badaniach widzę dużo urządzeń, które mają ogromny potencjał do usprawnienia procedur operacyjnych. Głęboko wierzę,  że niektóre z nich staną się „krokiem milowym światowej okulistyki” To nie jest sztuka dla sztuki. Lepszy sprzęt i technologia, to lepsza diagnostyka i większe bezpieczeństwo dla pacjenta podczas zabiegów operacyjnych. Mówię tu o możliwości obniżenia ilości powikłań zabiegów operacyjnych, a także o zwiększaniu trafności stawianych diagnoz. Sam jestem okulistą z wieloletnim doświadczeniem, wykonującym procedury operacyjne według najwyższych standardów, a wiem, że w przyszłości standardy będą jeszcze bardziej wyśrubowane.

Jak liczbowo wyglądają powikłania w Pana praktyce?

Temat powikłań jest wyjątkowo trudnym tematem dla każdego lekarza. Każdy czynny chirurg ma powikłania dlatego prawdziwe jest powiedzenie – „kto nie operuje ten nie ma powikłań”. Powikłania możemy rozpatrywać z punktu widzenia statystyki. Do liczb podawanych przez statystykę trzeba podchodzić ostrożnie. Nawet Mark Twain pisał już o statystyce, że są trzy rodzaje kłamstw: kłamstwa, bezczelne kłamstwa i statystyki.

Patrząc na powikłania przez pryzmat liczb, trzeba by wziąć pod uwagę konkretną procedurę, np. zabieg usunięcia zaćmy. Tutaj źródła podają wartości od 0,3 do 15% przypadków w zależności od stopnia skomplikowania przypadku. Traktuję powikłania jak lekcję z której wyciągam stale wnioski. Moje statystyki w zakresie powikłań kształtują się w dolnych zakresach statystycznej skali.

Gratuluję.

To wszystko w dużej mierze zależy od dokładności na którą ma wpływ również technologia. Technologia tworzona w ICTER z pewnością przyczyni się do zmniejszenia ilości powikłań podczas wykonywania procedur operacyjnych. Następną gałęzią, w której widzę ogromny potencjał, jest oczywiście diagnostyka. Zaawansowane technologia  w oczywisty sposób wpłynie też na zwiększenie ilości trafnych diagnoz, a także umożliwi spojrzenie na daną patologię z szerszej perspektywy. Nie wystarczy chcieć wyleczyć pacjenta – musimy najpierw wiedzieć, co leczyć.

Ile zabiegów usunięcia zaćmy a wszczepieniem sztucznej soczewki  wewnątrzgałkowych  wykonuje się w Polsce?

W Polsce takich zabiegów wykonuje się około 300 tysięcy rocznie. Natomiast na świecie zabiegów wszczepień soczewki wykonuje się ok. 20 milionów. Przez ostatnie trzy lata, z uwagi na COVID i sytuację geopolityczną, te dane uległy dużym fluktuacjom.

Chirurgia okulistyczna w klinice oka

Kolejną gałęzią rozwijaną przez ICTER są terapie genowe. Jakie widzi Pan tu perspektywy?

Terapie genowe to przede wszystkim szansa dla pacjentów, którzy nie widzą z powodu wad genetycznych, np. cierpiących na wrodzoną ślepotę Lebera (LCA). U osób nią dotkniętych, fotoreceptory oka przestają reagować na światło, a przyczyną jest mutacja genu kodującego białko niezbędne w procesie widzenia. W wieku ok. 20 lat dochodzi do całkowitej ślepoty. Prace nad terapią genową, która usuwałaby lub chociaż łagodziła objawy LCA trwają od niemal 15 lat, ale już wkrótce możemy mieć gotowy lek. To właśnie  takie instytuty badawcze jak ICTER umożliwiają ten postęp.

Uważa Pan, że terapia genowa ma szansę zaistnieć w polskiej medycynie w ciągu najbliższych kilku lat?

Trzeba realnie podejść do tego tematu. Wprowadzenie leku na rynek to koszt setek milionów dolarów. Badania na poszczególnych etapach –  badania klinicznego , badania na modelach zwierzęcych, na zdrowych ochotnikach, następnie na chorych są bardzo długie. Mówimy tu o okresie 5-10 lat.

Czy oprócz badań, w których dzisiaj uczestniczy Pan wraz z naszymi naukowcami, a dotyczącymi pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane, planuje Pan rozszerzyć współpracę z nami na przykład o badania pacjentów z innymi schorzeniami?

Oczywiście. Myślę, że w następnym etapie mogli by być pacjenci ze zwyrodnieniem plamki żółtej (AMD). Widzę tutaj potencjał w diagnostyce, kontrolowaniu przebiegu choroby oraz skuteczności leczenia. Dotychczasowe urządzenia pozwalają na obrazowanie strukturalne, w którym widzimy zmiany anatomiczne w różnych warstwach oka, ale nie pozwalają na obrazowanie funkcjonalne, czyli nie możemy określić, jaki jest stan substancji kluczowych dla biochemii widzenia. Dlatego czasami zdarza się,  że operacja się udała, a mimo to pacjent nie czuje poprawy widzenia. Można by uniknąć takich sytuacji, gdybyśmy przed samym zabiegiem wiedzieli, czy część, którą zamierzamy naprawić w ogóle funkcjonuje. I właśnie tutaj widzę ogromny potencjał we współpracy z Międzynarodowym Centrum Badań Oka.

Chcemy korzystać z Pańskiego doświadczenia w praktyce okulistycznej.  To może pomóc nam dookreślić potrzeby lekarzy i udoskonalić sprzęt, który konstruujemy. Czy ma Pan już teraz  dla nas  jakieś wskazówki?

Przede wszystkim, aby dane urządzenie mogło zostać wprowadzone do gabinetów lekarskich i na sale operacyjne, musi być skuteczne i proste. I nie chodzi tu o prostą konstrukcję czy też zasadę działania – nie każdy musi wiedzieć, jak coś działa. Wiele osób musi umieć dane urządzenie obsłużyć. W ICTER stworzonych jest wiele urządzeń, jak na przykład układy badające funkcję receptorów siatkówki, które po odpowiednim „opakowaniu” mogłyby w krótkim czasie stanąć w klinikach. Kluczowe jest skonstruowanie odpowiedniego oprogramowania tak, aby do używania sprzętu nie był potrzebny inżynier, a wystarczył technik czy też lekarz po krótkim szkoleniu. Drugim elementem jest ergonomia i wygoda dla pacjenta. Nie ukrywajmy, większość  pacjentów to osoby starsze, nieraz mające problemy z poruszaniem się, nie mówiąc o spędzeniu 20 minut w bezruchu podczas badania. Dodatkowo, niektóre procedury są dla nich wyjątkowo frustrujące, szczególnie podczas sytuacji, gdy mają patrzeć na jasny punkt, a oni po prostu go nie widzą, gdyż siatkówka jest w tym miejscu zmieniona chorobowo. Moim celem jest przedstawienie naukowcom klinicznego punkt uwidzenia.

Uważam, że na naszej współpracy, pomijając moją niekwestionowaną satysfakcję, najbardziej skorzystają pacjenci. Fuzja technologii, medycyny, nauki i praktyki zawsze przynosi korzyści wszystkim zainteresowanym. Jestem przekonany, że tak samo będzie w naszym przypadku. Nie mogę się już doczekać owoców tej współpracy.

My też.

Dziękuję za rozmowę.

BIO

Piotr Chaniecki obecnie pełni funkcję głównego chirurga w Ośrodku Chirurgii Oka Prof. Zagórskiego w Krakowie. Jego profesjonalna przeszłość obejmuje ukończenie Wojskowej Akademii Medycznej w Łodzi w 1996 roku. Pełnił także rolę Ordynatora Klinicznego Oddziału Okulistycznego 5 Wojskowego Szpitala Klinicznego w Krakowie oraz Oddziału Okulistycznego w Szpitalu im. PCK w Gdyni.
Jego głównymi obszarami zainteresowań zawodowych są chirurgia przedniego i tylnego odcinka oka oraz zachowawcze leczenie chorób oczu. Jest autorem unikalnej techniki operacyjnej wymiany soczewek wewnątrzgałkowych, która została wyróżniona jako najlepsza technika operacyjna roku 2019 przez amerykańskie czasopismo okulistyczne Cataract & Refractive Surgery Today. W 2016 roku otrzymał nagrodę za najlepszą pracę naukową pt. „Composition of phacoemulsificated human lenses analyzed by infrared spectroscopy” przyznaną przez European Association for Vision and Eye Research.

———————————————————————————————————————————————————————————————-

Wywiad poprowadził naukowiec z ICTER, Postdoc dr Michał Dąbrowski.

Edycja i korekta tekstu: redaktor mgr Marcin Powęska.

22.06.2023

Mikrofluidyczne układy kroplowe

Mikrofluidyczne układy kroplowe pozwalają na manipulowanie małymi objętościami cieczy o dwóch niemieszających się fazach, np. wody i oleju. W efekcie powstaje mały reaktor, w którym można przeprowadzać i obserwować w czasie reakcję chemiczną lub proces biologiczny. Mikrokropelki mogą być mieszane, sortowane, inkubowane i analizowane. Operacje te mogą być wykonywane w specjalnie zaprojektowanych układach mikrofluidycznych, tworząc małe urządzenie typu „lab-on-a-chip”. Głównym celem naszych badań jest obserwacja zachowania klinicznie istotnych szczepów bakterii, w szczególności, jak reagują one na antybiotyki. Zastosowanie optyki i techniki laserowej w połączeniu z układami mikrofluidycznymi pozwala na znacznie szybsze przeprowadzanie eksperymentów.

Antybiotykooporność (antimicrobial resistance, AMR) jest jednym z najpilniejszych zagrożeń dla zdrowia na świecie. Występuje ona, gdy bakterie, wirusy, grzyby i pasożyty przekształcają się z czasem i nie reagują już na leki. W rezultacie antybiotyki lub inne leki przeciwdrobnoustrojowe stają się nieskuteczne i nie pozwalają leczyć chorób. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała AMR za jedno z 10 największych zagrożeń dla zdrowia publicznego na świecie.

Monitorowanie zachowania bakterii, tj. ich wzrostu, jest trudnym i czasochłonnym zadaniem, szczególnie gdy musimy śledzić tysiące lub miliony powtórzeń eksperymentów. Metody optyczne w połączeniu z mikrofluidyką pozwalają nam rozwiązać ten problem. Możemy przesuwać krople przed wiązką lasera i analizować światło rozproszone na komórkach bakterii za pomocą specjalnie zaprojektowanych chipów. Intensywność rozproszonego światła jest związana z koncentracją bakterii w kroplach, a my możemy śledzić ją w czasie. Możemy monitorować ponad 1000 kropli na sekundę i analizować je za pomocą dedykowanego oprogramowania. Dodatkowo, możemy również uczynić system bardziej kompaktowym i łatwiejszym w użyciu poprzez zastosowanie optyki światłowodowej, zaproponowaliśmy układ, w którym specjalnie dobrane włókno optyczne jest wykorzystywane do zbierania światła rozproszonego na bakteriach [1].

Z drugiej strony, poważne, nie gojące się infekcje są jednak często wywoływane przez wiele patogenów lub warianty genetyczne tego samego patogenu wykazujące różne poziomy oporności na antybiotyki. Przykładowo, polimikrobowe zakażenia stopy cukrzycowej podwajają ryzyko amputacji w porównaniu z zakażeniami monomikrobowymi. Chociaż infekcje te prowadzą do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności, standardowe metody oznaczania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe są zaprojektowane dla jednorodnych próbek i nie sprawdzają się w ilościowym określaniu heterooporności. Proponujemy opartą na kroplach metodę do ilościowego określania odpowiedzi antybiotykowej całej populacji na poziomie pojedynczej komórki. Wykorzystaliśmy próbki Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, aby potwierdzić, że możemy uzskać informacje o współistnieniu różnych subpopulacji bakterii, ich wielkości i heterooporności na antybiotyki [2].

Autor: dr Jakub Bogusławski

Zespół:

dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

dr Kamil Liżewski klizewski@ichf.edu.pl

Prof. Maciej Wojtkowski mwojtkowski@ichf.edu.pl

Publikacje:

  1. Natalia Pacocha, Jakub Bogusławski, Michał Horka, Karol Makuch, Kamil Liżewski, Maciej Wojtkowski, Piotr Garstecki, „High-Throughput Monitoring of Bacterial Cell Density in Nanoliter Droplets: Label-Free Detection of Unmodified Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria,” Analytical Chemistry (2020).
  2. Natalia Pacocha, Marta Zapotoczna, Karol Makuch, Jakub Bogusławski, Piotr Garstecki, “You will know by its tail: a method for quantification of heterogeneity of bacterial populations using single-cell MIC profiling,” Lab on a Chip 22, 4317-4326 (2022).
20.06.2023

Nieinwazyjna optoretinografia (ORG)

Od wielu lat okuliści wykorzystują wizualną kontrolę fotografii dna oka [1] oraz obrazów uzyskanych za pomocą optycznej tomografii koherencyjnej (ang. Optical Coherence Tomography – OCT) [2] do diagnozowania chorób oczu i monitorowania postępów terapii dzięki ich zdolności do wykrywania zmian morfologicznych w siatkówce oka. Jednak samo obrazowanie morfologicznych objawów chorób nie dostarcza wystarczających informacji na temat utraty funkcji fotoreceptorów.

Ponad dekadę temu wykazano, że optyczna tomografia koherencyjna może wykrywać niewielkie zmiany intensywności światła podczerwonego odbitego od siatkówek zwierzęcych in vitro [3,4] i in vivo [5] występujące po jednoczesnej stymulacji światłem widzialnym. Odkrycia te stworzyło podwaliny pod rozwój optoretinografii (ang. optoretinography – ORG) [6], metody, która mierzy odpowiedź siatkówki oka na światło, dając tym samym możliwość uzyskania informacji o działaniu neuronów siatkówki (fotoreceptorów).

W ICTER pracujemy nad rozwojem ORG ze stymulacją siatkówki pojedynczym impulsem światła, jak światłem migoczącym [7]. Aby uzyskać dane ORG, używamy tomografii STOC (ang. Spatio-Temporal Optical Coherence-Tomography) [8], która pozwala nam rejestrować trójwymiarowe objętościowe obrazy siatkówki w ciągu kilku milisekund. Po przetworzeniu danych wyodrębniamy sygnały ORG, śledząc zmiany w siatkówce zachodzące między błoną graniczną (ang. inner and outer photoreceptor junction – IS/OS) a końcówkami zewnętrznego segmentu czopków (ang. cone outer segment tips – COST). Rysunek (a) pokazuje lokalizację źródła sygnału ORG na tomograficznym obrazie siatkówki oka ludzkiego.

Przykładowe wyniki pokazujące odpowiedzi siatkówki zaadaptowanej do ciemności na pojedynczy impuls światła pokazano na rys. (b) i (c). Rysunek (b) przedstawia uśredniony przestrzennie sygnał ORG w funkcji czasu zarejestrowany dla równomiernie rozłożonego bodźca. Natomiast rys. (c) pokazuje maksymalną amplitudę sygnału ORG na obrazowanej części powierzchni siatkówki w odpowiedzi na stymulację wzorem zawierającym literę E.

W eksperymentach f-ORG (ang. Flicker ORG), które są główną tematyką naszych prac, do stymulacji siatkówki wykorzystywane jest migoczące światło. Po raz pierwszy takie badanie przeprowadzili Schmoll i wsp. i zmierzyli oni odpowiedź fotoreceptorów na migotanie o częstotliwości 5 Hz [9], W ostatnim czasie, natomiast grupa z Lübeck zmierzyła odpowiedź na różne częstotliwości migotania (od 1 Hz do 6,6 Hz) [10]. Nasza metodologia f-ORG pozwala na pomiar odpowiedzi siatkówki w szerszym zakresie częstotliwości i mapowanie odpowiedzi fotoreceptorów na migoczące światło na powierzchni siatkówki. Przykładowe wyniki zmierzonych charakterystyk częstotliwościowych odpowiedzi u czterech zdrowych osób przedstawiono na rys. (d). Natomiast przykład przestrzennie wykrytej odpowiedzi siatkówki na bodziec projektowany przy użyciu DMD z paskami światła migoczącymi z różnymi częstotliwościami przedstawiono na rys. (e).

Tekst: dr Sławomir Tomczewski, PhD,

Zespół:

dr Sławomir Tomczewski

mgr Piotr Węgrzyn

dr habil. Dawid Borycki

dr Egidijus Auksorius

mgr Maciej Wielgo

Prof. Maciej Wojtkowski

dr Andrea Curatolo

Słowa kluczowe: Optyczna Tomografia Koherencyjna, STOC-T, OCT, Optoretinografia, Migotanie, f-ORG.

Publikacje:

  1. V. J. Srinivasan, M. Wojtkowski, J. G. Fujimoto, and J. S. Duker, „In vivo measurement of retinal physiology with high-speed ultrahigh-resolution optical coherence tomography,” Opt. Lett. 31, 2308 (2006).
  2. S. Tomczewski, P. Węgrzyn, D. Borycki, E. Auksorius, M. Wojtkowski, and A. Curatolo, „Light-adapted flicker optoretinograms captured with a spatio-temporal optical coherence-tomography (STOC-T) system,” Biomed. Opt. Express 13, 2186 (2022).
  3. E. Auksorius, D. Borycki, P. Wegrzyn, B. L. Sikorski, K. Lizewski, I. Zickiene, M. Rapolu, K. Adomavicius, S. Tomczewski, and M. Wojtkowski, „Spatio-Temporal Optical Coherence Tomography provides full thickness imaging of the chorioretinal complex,” iScience 25, 105513 (2022).
15.06.2023

Skaningowy oftalmoskop laserowy z dwufotonowo pobudzaną fluorescencją (TPEF-SLO)

Zdolność do nieinwazyjnego dostępu do procesów metabolicznych podczas cyklu wzrokowego ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii przeciwko chorobom zwyrodnieniowym siatkówki. Opracowaliśmy protokół uzyskiwania in vivo obrazów fluorescencji wzbudzonego dwufotonowo dna oka ludzkiego.

Cykl widzenia to seria przemian chemicznych, podczas których powstają różne półprodukty fluorescencyjne. Autofluorescencja dna oka indukowana niebieskim światłem umożliwia obrazowanie fluoroforów siatkówki. Jednak ze względu na fundamentalne ograniczenia metoda ta ogranicza się do obrazowania lipofuscyn, które zawierają produkty uboczne cyklu wzrokowego, ale nie odzwierciedlają bezpośrednio zmian w funkcji fotoreceptorów. Widma absorpcyjne fluoroforów biorących udział w cyklu wdzenia, takich jak estry retinylu, mieszczą się w zakresie widmowym UV. Jednak absorpcja i rozpraszanie w przedniej części oka, a także względy bezpieczeństwa wykluczają promieniowanie UV z zastosowań w obrazowaniu okulistycznym.

Wzbudzenie dwufotonowe pozwala ominąć to ograniczenie i wzbudzić niedostępne wcześniej fluorofory, tworząc nowe możliwości diagnostyczne. Fluorofory siatkówki mogą być wzbudzane przy minimalnej absorpcji i znacznie niższym rozpraszaniu i fototoksyczności przy użyciu impulsów femtosekundowych o długości fal bliskiej podczerwieni. Wcześniej pokazaliśmy, że obrazowanie za pomocą skanującego oftalmoskopu laserowego z dwufotonowo-wzbudzaną absorpcją okazało się bardzo przydatne u myszy. Niedawno, w 2022 roku, po raz pierwszy zedemonstrowaliśmy obrazowanie oka ludzkiego in vivo przy użyciu dwufotonowo-wzbudzanej fluorescencji w bliskiej podczerwieni. Zbudowaliśmy kompaktowy instrument oparty na skaningowym oftalmoskopie laserowym (SLO) z niestandardowym femtosekundowym laserem światłowodowym i wydajną detekcją fotonów oraz zaprojektowaliśmy zaawansowane przetwarzanie danych, które umożliwiło pomiar sygnałów dwufotonowych na poziomie pojedynczych fotonów. W rezultacie możemy zwizualizować rozkład fluoroforów siatkówki przy ekspozycji znacznie poniżej granicy bezpieczeństwa dla ludzkiego oka.

Zmierzyliśmy dziesiątki ochotników, aby potwierdzić solidność techniki i rozszerzyliśmy konfigurację eksperymentalną o pracę z modelami mysimi w celu zbadania różnych chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem czy choroba Stargardta. Obrazowanie przeprowadzono w ciemnym pokoju bez wcześniejszej adaptacji do ciemności lub rozszerzenia źrenic. W większości przypadków udało nam się zarejestrować sygnał fluorescencyjny i zrekonstruować obraz siatkówki. Technika ta rozwiewa obawy dotyczące bezpieczeństwa, umożliwiając uzyskiwanie dobrej jakości obrazów przy niskiej ekspozycji oka na światło lasera. Potwierdziliśmy przydatność systemu do przyszłego zastosowania klinicznego tej metody obrazowania. Nasze wyniki stanowią istotny krok w kierunku funkcjonalnego obrazowania ludzkiego oka, które bezpośrednio odzwierciedla lokalne zmiany w funkcji siatkówki.

Tekst: dr Michał Dąbrowski

Figure 1: a Example TPEF images of the human retina with different spectra filter on PMT detector.      b The same but for mice retina. c Comparison of fluorescence signal intensity for different spectra filter both for humans and several mice models. d FLIM images along with phasor plot representations.
Rysunek 1: a Przykładowe obrazy dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji dla siatkówki ludzkiej i różnych filtrów spektralnych na detektorze (fotopowielacz). b Analogiczne obrazy dla siatkówki mysiej. c Porównanie intensywności sygnału fluorescencji dla różnych filtrów spektralnych, dla ludzi i różnych modeli mysich. d Obrazy dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji w siatkówce mysiej, wraz z reprezentacją fazorową.

Zespół:

dr Michał Dąbrowski

dr Sławomir Tomczewski

dr Agata Kotulska

dr Marcin J. Marzejon

dr Jakub Bogusławski

Prof. Maciej Wojtkowski

Publikacje:

  1. G. Palczewska, J. Boguslawski, P. Stremplewski, Ł. Kornaszewski, J. Zhang, Z. Dong, X.-X. Liang, E. Gratton, A. Vogel, M. Wojtkowski, and K. Palczewski, Noninvasive two-photon optical biopsy of retinal fluorophores, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 117, 22532 (2020)
  2. D. Stachowiak, J. Bogusławski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, M. Wojtkowski, and G. Soboń, „Frequency-doubled femtosecond Er-doped fiber laser for two-photon excited fluorescence imaging, Biomed. Opt. Express 11, 4431 (2020)
  3. J. Boguslawski, G. Palczewska, S. Tomczewski, J. Milkiewicz, P.Kasprzycki, D. Stachowiak, K. Komar, M. J. Marzejon, B. L. Sikorski, A. Hudzikowski, A. Głuszek, Z. Łaszczych, K. Karnowski, G. Soboń, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, In vivo imaginh of the human eye using a 2-photon-excited fluorescence scanning laser ophthalmoscope, JCI 132, 154218 (2022)
  4. J. Bogusławski, S. Tomczewski, M. Dąbrowski, K. Komar, J. Milkiewicz, G. Palczewska, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, In vivo imaging of the muna retina using a two-photon excited fluorescence ophthalmoscope, STAR Protocols 4, 102225 (2023)
  5. G. Palczewska, M. Wojtkowski, and K. Palczewski, From mouse to human: Accessing the biochemistry of vision in vivo by two-photon excitation, Prog. Retin. Eye Res. 93, 101170 (2023)
15.06.2023

Widzenie dwufotonowe

Wzrok jest zdolnością do odbierania bodźców z otaczającego nas otoczenia w postaci fal elektromagnetycznych od 400 nm do 780 nm, nazywanego zakresem światła widzialnego. Proces widzenia zaczyna się w momencie, gdy foton światła widzialnego zostanie zaabsorbowany przez pigment wzrokowy fotoreceptora w światłoczułej części oka – siatkówce. Absorpcja fotonu inicjuje szereg reakcji biochemicznych, w wyniku których światło jest zamienione na sygnał elektryczny, przetwarzany później w mózgu.

Widzenie dwufotonowe polega na tym, że człowiek widzi ultrakrótkie impulsy lasera z zakresu bliskiej podczerwieni na skutek nieliniowego procesu optycznego – absorpcji dwufotonowej zachodzącej w pigmentach wzrokowych. Aparat wzrokowy reaguje tak, jakby w fotoreceptorach został zaabsorbowany jeden foton światła, podczas gdy absorbowane są dwa fotony promieniowania podczerwonego o dwukrotnie niższej energii. Bodziec jest postrzegany przez obserwatora tak, jakby miał kolor odpowiadający około połowie długości fali pobudzającej wiązki lasera podczerwonego.

Widzenie dwufotonowe ma kilka ciekawych właściwości innych od „normalnego”, jednofotonowego widzenia. Po pierwsze zachodzi dla innego zakresu spektralnego: od około 800 nm do 1300 nm – dla tych długości fali wrażenie barwne zmienia się od barwy niebieskiej, poprzez zieloną, żółtą, aż do czerwieni. Po drugie jasność bodźca dwufotonowego zmienia się kwadratowo z mocą promieniowania optycznego, a więc światło rozproszone w oku nie będzie postrzegane. Jasność zależy również od zogniskowania wiązki na siatkówce obserwatora. Obserwowane bodźce są bardziej ostre i o lepszym kontraście niż w przypadku „normalnego”, jednofotonowego widzenia.

W Międzynarodowym Centrum Badań Oka badamy zjawisko widzenia dwufotonowego – poznajemy właściwości tego procesu i jako pierwsi na świecie opisujemy je. Szukamy również zastosowań tego zjawiska, zarówno w diagnostyce medycznej (np. mikroperymetria dwufotonowa), jak i systemach wizualizacji informacji.

Mikroperymetria dwufotonowa

Konwencjonalne podejście do badania pola widzenia opiera się na wyświetlaniu bodźców widzialnych w różnych miejscach siatkówki pacjenta i rejestracji jej/jego odpowiedzi. Niestety, dokładność i powtarzalność klasycznych metod badania pola widzenia jest ograniczona. Nie możemy jej użyć w przypadkach pacjentów z nieprzeziernością ośrodka optycznego oka (np. zaćma).

Odpowiedzią na powyższe wyzwania może być mikroperymetria dwufotonowa – nowa technika diagnostyczna wykorzystująca impulsowe wiązki podczerwone do pobudzania siatkówki oka osoby badanej. Takie bodźce są postrzegane w procesie widzenia dwufotonowego. Zastosowanie dwufotonowej percepcji do badania pola widzenia ma kilka zalet. W przeciwieństwie do światła widzialnego, promieniowanie podczerwone jest mniej rozpraszane na nieprzeziernościach ośrodka optycznego oka. Ponadto, widzenie dwufotonowe jest procesem nieliniowym, co powoduje o połowę mniejszy rozrzut wartości progu widzenia w porównaniu do klasycznej mikroperymetrii. To przekłada się na lepszą powtarzalność badania.

W Międzynarodowym Centrum Badań Oka badamy rozwijamy technikę mikroperymetrii dwufotonowej, między innymi badając wpływ różnych parametrów impulsowych źródeł laserowych – długości fali, długości impulsu i częstotliwości repetycji, na efektywność pobudzania siatkówki.

Autorzy: dr Katarzyna Komar i dr Marcin Marzejon

Zespół:

dr Katarzyna Komar

dr Marcin Marzejon

mgr Oliwia Kaczkoś

dr Agata Kotulska

Prof. Maciej Wojtkowski

Publikacje:

  1. G. Palczewska, F. Vinberg, P. Stremplewski, M. P. Bircher, D. Salom, K. Komar, J. Zhang, M. Cascella, M. Wojtkowski, V. J. Kefalov, and K. Palczewski, “Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(50), E5445–E5454 (2014).
  2. D. Ruminski, G. Palczewska, M. Nowakowski, V. Kefalov, K. Komar, K. Palczewski, and M. Wojtkowski, “Two-photon microperimetry: sensitivity of human photoreceptors to infrared light,” Biomed. Opt. Express 10(9), 4551–4567 (2019).
  3. G. Łabuz, A. Rayamajhi, J. Usinger, K. Komar, P. Merz, R. Khoramnia, G. Palczewska, K. Palczewski, and G. U. Auffarth, “Clinical application of infrared-light microperimetry in the assessment of scotopic-eye sensitivity,” Transl. Vis. Sci. Technol. 9(8), 1–9 (2020).
  4. M. J. Marzejon, Ł. Kornaszewski, J. Bogusławski, P. Ciąćka, M. Martynow, G. Palczewska, S. Maćkowski, K. Palczewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Two-photon microperimetry with picosecond pulses,” Biomed. Opt. Express 12(1), 462–479 (2021).
  5. M. Marzejon, Ł. Kornaszewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Effects of laser pulse duration in two-photon vision threshold measurements,” in Ophthalmic Technologies XXXI, D. X. Hammer, K. M. Joos, and D. V Palanker, eds. (SPIE, 2021), 11623, pp. 74–79.
  6. G. Łabuz, A. Rayamajhi, R. Khoramnia, G. Palczewska, K. Palczewski, A. Holschbach, and G. U. Auffarth, “The loss of infrared-light sensitivity of photoreceptor cells measured with two-photon excitation as an indicator of diabetic retinopathy: A pilot study,” Retina 41(6), 1302–1308 (2021).
  7. D. Stachowiak, M. Marzejon, J. Bogusławski, Z. Łaszczych, K. Komar, M. Wojtkowski, and G. Soboń, “Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomed. Opt. Express 13(4), 1899–1911 (2022).
  8. A. Zielińska, P. Ciąćka, M. Szkulmowski, and K. Komar, „Pupillary Light Reflex Induced by Two-Photon Vision,” Investig. Opthalmology Vis. Sci. 62(15), 23 (2021).
  9. M. J. Marzejon, “Two-photon perimetry utilizing picosecond lasers,” Gdańsk University of Technology (2022).
  10. O. Kaczkoś, A. Zielińska, M. J. Marzejon, J. Solarz-Niesłuchowski, J. Pniewski, K. Komar, “Methods of determining the contrast sensitivity function for two-photon vision,” Proc. SPIE 12502, 1250215 (2022).
  11. G. Łabuz, A. Rayamajhi, K. Komar, R. Khoramnia, and G. U. Auffarth, “Infrared- and white-light retinal sensitivity in glaucomatous neuropathy,” Sci. Rep. 12(1), 1961 (2022).
  12. M. J. Marzejon, PhD thesis “Two-photon perimetry utilizing picosecond lasers”, Gdańsk University of Technology (2022).
  13. D. Stachowiak, M. Marzejon, J. Bogusławski, Z. Łaszczych, K. Komar, M. Wojtkowski, and G. Soboń, “Femtosecond Er-doped fiber laser source tunable from 872 to 1075 nm for two-photon vision studies in humans,” Biomed. Opt. Express 13(4), 1899–1911 (2022).
  14. M. J. Marzejon, Ł. Kornaszewski, M. Wojtkowski, and K. Komar, “Laser pulse train parameters determine the brightness of a two-photon stimulus”,  Biomed. Opt. Express 14(4), 2857-2872 (2023).

09.06.2023

Dwufotonowa biopsja optyczna siatkówki oka

Siatkówka jest istotną częścią oka, ponieważ jest odpowiedzialna za przekształcanie światła w sygnały elektryczne, które są później przetwarzane w mózgu. Działa jak biologiczny fotodetektor. Obrazowanie struktury i funkcji żywej siatkówki ma kluczowe znaczenie dla skutecznego diagnozowania i leczenia chorób oczu oraz opracowywania leków. Informacje strukturalne o siatkówce można uzyskać m.in. dzięki badaniom OCT. Jednakże, zmiany funkcjonalne są pierwszymi oznakami wczesnych procesów patologicznych i często poprzedzają zmiany strukturalne; uzyskanie tych informacji jest obecnie bardzo trudne. Naukowcy z ICTER pracują nad nową metodą funkcjonalnego obrazowania dna oka, bazując na dwufotonowo wzbudzanej fluorescencji.

Siatkówka ma strukturę warstwową, która jest wypełniona różnymi fluoroforami. Na przykład, nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) zawiera lipofuscynę, produkt uboczny cyklu widzenia. Lipofuscyna gromadzi się z wiekiem, ale także wraz z postępem choroby. Inne przykłady to retinol i estry retinylowe (pochodne witaminy A aktywne w cyklu wzrokowym), melanina, FAD, NADH, kolagen i elastyna. Substancje te mogą dostarczyć cennych informacji o stanie zdrowia siatkówki i mogą być cennym narzędziem do wykrywania zmian funkcjonalnych w przebiegu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej lub jaskry.

Standardowe obrazowanie autofluorescencji oka wizualizuje rozkład fluoroforów siatkówki, ale dostępna jest tylko informacja o intensywności. W rezultacie sygnały pochodzące od różnych fluoroforów nie mogą być rozróżnione. Lipofuscyna jest dominującym fluoroforem, a jej silny sygnał miesza się z innymi, pochodzącymi zwykle z znacznie słabszych źródeł. Różne fluorofory różnią się właściwościami fluorescencji, tj. czasem życia fluorescencji i widmem fluorescencji. Stanowi to dodatkowy parametr dyskryminacyjny, który pozwala je od siebie odróżnić.

Oko jest oknem na świat, ale ma też określony zakres transmisji. W związku z tym, wiele fluoroforów o widmach wzbudzenia w zakresie UV/niebieskim (<420 nm) nie może być wzbudzonych, a informacja w nich zawarta jest niedostępna. Naszym rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie wzbudzenia dwufotonowego. Schemat ten wykorzystuje krótkie (femtosekundowe) impulsy w bliskiej podczerwieni (dwukrotna długość fali), co pozwala ominąć ograniczenia wynikające z transmisji oka. Przykładowo, użycie impulsów femtosekundowych o długości fali 730 nm jest równoważne wzbudzeniu jednofotonowemu o długości fali 365 nm, co nie byłoby możliwe w żywym oku. Dodatkowe zalety tej metody to lepsza rozdzielczość, mniejsza fototoksyczność i mniejsze rozpraszanie.

W naszych badaniach dążymy do wizualizacji struktury i składu molekularnego tkanek oka, wykorzystując zarówno dyskryminację spektralną, jak i czasową. Przykładowo, obraz poniżej przedstawia rozkład czasu życia fluorescencji (FLIM) komórek nabłonka pigmentu siatkówki myszy Abca4PV/PV (model choroby Stargardta u ludzi). Obraz odzwierciedla różnice w subkomórkowej dystrybucji endogennych fluoroforów w nabłonku barwnikowym. Krótsze czasy życia (kolor niebiesko-zielony) są związane z A2E, składnikiem lipofuscyny. Czerwone granulki (dłuższy czas życia) mogą być związane z estrami retinylowymi.

Autor: dr Jakub Bogusławski jboguslawski@ichf.edu.pl

Zespół: Grażyna Palczewska, Jakub Bogusławski, Łukasz Kornaszewski, Maciej Wojtkowski

Publikacja:

Grazyna Palczewska, Jakub Boguslawski, Patrycjusz Stremplewski, Lukasz Kornaszewski, Jianye Zhang, Zhiqian Dong, Xiao-Xuan Liang, Enrico Gratton, Alfred Vogel, Maciej Wojtkowski, Krzysztof Palczewski, “Noninvasive two-photon optical biopsy of retinal fluorophores,” Proceedings of the National Academy of Sciences 117(36), 22532-22543 (2020).