16.12.2024

Hybrydowa rodopsyna jako nowe narzędzie optogenetyczne

Zaburzenia widzenia dotyczą milionów ludzi na całym świecie, a liczba osób chorych rośnie ze względu na starzejące się społeczeństwo i powszechne występowanie chorób przewlekłych. Przewiduje się, że do 2050 roku 61 milionów ludzi będzie niewidomych, a 474 miliony będą miały umiarkowany lub poważny problem z widzeniem. Osłabienie lub utrata wzroku wpływa na życie osób nim dotkniętych, utrudniając codzienne czynności, prowadząc do utraty niezależności i zwiększając ryzyko chorób psychicznych. Dlatego tak ważne jest poszukiwanie skutecznych terapii, które spowolnią postęp choroby i przywrócą widzenie. Ostatnio najskuteczniejszymi sposobami przywracania widzenia okazały się wirusowe terapie genowe dostarczające prawidłowe kopie wadliwych genów lub narzędzia optogenetyczne. Jest to związane głównie z uprzywilejowanym statusem immunologicznym i łatwą dostępnością oka do dostarczania terapii genowej. Pierwsza terapia genowa oparta na AAV (ang. adeno associated virus, wirus towarzyszący adenowirusom), która poprawia wzrok u pacjentów z dystrofią siatkówki, została zatwierdzona przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA) w 2017 roku. Istnieje również wiele terapii genowych opartych na AAV skoncentrowanych na dostarczaniu różnych wariantów światłoczułych opsyn, poddanych badaniom klinicznym. Ponieważ wspomniane badania kliniczne koncentrują się na opsynach, które pełnią swoją funkcję przy wysokich natężeniach światła, wciąż istnieje potrzeba zaprojektowania narzędzia optogenetycznego, które byłoby z powodzeniem aktywowane przy stosunkowo niskiej stymulacji świetlnej. W zdrowej siatkówce sygnały odbierane z aktywowanych światłem fotoreceptorów przetwarzane są następnie przez komórki dwubiegunowe, które wysyłają informaję dalej do kmórek amakrynowych i zwojowych. Jednak, w zdegenerowanej siatkówce nieodwracalne zmiany i mutacje powodują utratę pręcików i czopków wykrywających światło. Pomimo utraty fotoreceptorów i zmian strukturalnych, pozostałe komórki w dużej mierze zachowują swoje funkcje.

W tym projekcie zamierzamy opracować nowe opsyny o zwiększonej funkcjonalności, aby przywrócić naturalne mechanizmy przetwarzania informacji wzrokowej w zdegenerowanej siatkówce. Proponujemy, że chimeryczne warianty RecRho mogą stanowić nową strategię terapii genowej w chorobach siatkówki. Stawiamy hipotezę, że chimeryczne warianty RecRho wprowadzone do ocalałych populacji komórek w obrębie zdegenerowanej siatkówki mogą być aktywowane przez umiarkowane poziomy światła, dzięki czemu przekształcą transdukowane komórki w bezpośrednie detektory światła i przywrócą wysoki poziom widzenia. Wierzymy, że nasze chimeryczne białka oprócz przekształcania transdukowanych komórek w bezpośrednie detektory światła, będą dodatkowo pozytywnie wpływać na strukturę i plastyczność synaptyczną w całej siatkówce. Do celów testowania efektów proponowanej terapii prowadzimy rejestracje aktywności pojedynczych neuronów i zadania behawioralne polegające na rozróżnianiu bodźców wzrokowych, ocenimy selektywność sieci wzrokowej w odpowiedzi na złożone i poruszające się bodźce. Proponowane przez nas podejście z wykorzystaniem syntetycznego białka o wielu funkcjach, opartego na szlaku transdukcji mGluR1, nie było do tej pory stosowane.

Obraz: Po lewej: przekrój siatkówki z komórkami niespecyficznie zainfekowanymi wirusem AAV-CAG-mNeon. (ONL – zewnętrzna warstwa jądrowa, INL – wewnętrzna warstwa jądrowa, RGC – warstwa komórek zwojowych siatkówki). AAV-CAG-mNeon (zielony), przeciwciało przeciwko rodopsynie (czerwony), DAPI (marker jądra, niebieski). Po prawej: Przykład eksperymentu Patch-Clamp przeprowadzonego na komórkach HEK293t, do których wprowadzona została sekwencja kodująca kanałorodopsynę-2. Komórkę stymulowano niebieskim światłem (473 nm) i rejestrowano indukowane światłem potencjały wywołane.

Tekst: dr Jagoda Płaczkiewicz

Zespół:

dr Jagoda Płaczkiewicz

dr hab. Andrzej Foik

Słowa kluczowe: siatkówka, rodopsyna, GPCRs, AAV, terapia genowa