19.10.2020 Nabłonek barwnikowy siatkówki (ang. Retinal pigment epithelium; RPE) znajduje się w tylnej części oka, bezpośrednio za siatkówką i odpowiada za dostarczanie do fotoreceptorów cząsteczek chemicznych wykorzystywanych w procesie widzenia. Jednym z białek produkowanych w komórkach RPE i niezbędnym dla widzenia jest enzym RPE65. Mutacja genu RPE65 leży u podstaw wrodzonej choroby genetycznej oczu objawiającej się ślepotą. W naszych badaniach wykorzystywaliśmy edytory adeniny (adenine base editors, ABEs) w systemie Cas9 – sg RNA (ang. single-guide RNA), aby otworzyć de novo ścieżkę mutacji punktowych w celu ich naprawy. Geny kodujące ABEs i system Cas9 dostarczyliśmy do komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocą wektorów lentiwirusowych w iniekcji podsiatkówkowej. W wyniku zastosowanej metody terapeutycznej chorobotwórcze mutacje zostały naprawione z wydajnością do 29% z bardzo ograniczonym występowaniem mutacji typu indel (insercja -delecja) lub off-target. Uzyskana wydajność naprawcza edytorów adeniny była wystarczająca, aby u myszy poddanych terapii przywrócona została zarówno ekspresja białka RPE65 i jego aktywność niezbędna dla cyklu widzenia. Zaobserwowaliśmy również odzyskane niemal na poziomie normalnym funkcje siatkówki i funkcje wzrokowe. Obiecujące wyniki naszych badań są przesłanką do dalszych testów terapii wrodzonych chorób siatkówki z wykorzystaniem edytorów adeniny oraz badań nad korygowaniem chorobotwórczych mutacji za pomocą niekanonicznych sekwencji PAM (ang. non-canonical protospacer-adjacent motifs).
Autorzy:
dr Andrzej Foik, e-mail: afoik@ichf.edu.pl & dr Anna Posłuszny, e-mail: aposluszny@ichf.edu.pl
Publikacja:
Restoration of visual function in adult mice with an inherited retinal disease via adenine base editing
Susie Suh, Elliot H. Choi, Henri Leinonen, Andrzej T. Foik, Gregory A. Newby, Wei-Hsi Yeh, Zhiqian Dong, Philip D. Kiser, David C. Lyon, David R. Liu & Krzysztof Palczewski
Abstract
Cytosine base editors and adenine base editors (ABEs) can correct point mutations predictably and independent of Cas9-induced double-stranded DNA breaks (which causes substantial indel formation) and homology-directed repair (which typically leads to low editing efficiency). Here, we show, in adult mice, that a subretinal injection of a lentivirus expressing an ABE and a single-guide RNA targeting a de novo nonsense mutation in the Rpe65 gene corrects the pathogenic mutation with up to 29% efficiency and with minimal formation of indel and off-target mutations, despite the absence of the canonical NGG sequence as a protospacer-adjacent motif. The ABE-treated mice displayed restored RPE65 expression and retinoid isomerase activity, and near-normal levels of retinal and visual functions. Our findings motivate the further testing of ABEs for the treatment of inherited retinal diseases and for the correction of pathological mutations with non-canonical protospacer-adjacent motifs.
Link to publication
