Kategoria: Laboratorium Biologii Oka

Nabłonek barwnikowy siatkówki (ang. Retinal pigment epithelium; RPE) znajduje się w tylnej części oka, bezpośrednio za siatkówką i odpowiada za dostarczanie do fotoreceptorów cząsteczek chemicznych wykorzystywanych w procesie widzenia. Jednym z białek produkowanych w komórkach RPE i niezbędnym dla widzenia jest enzym RPE65. Mutacja genu RPE65 leży u podstaw wrodzonej choroby genetycznej oczu objawiającej się ślepotą. W naszych badaniach wykorzystywaliśmy edytory adeniny (adenine base editors, ABEs) w systemie Cas9 – sg RNA (ang. single-guide RNA), aby otworzyć de novo ścieżkę mutacji punktowych w celu ich naprawy. Geny kodujące ABEs i system Cas9 dostarczyliśmy do komórek nabłonka barwnikowego siatkówki za pomocą wektorów lentiwirusowych w iniekcji podsiatkówkowej. W wyniku zastosowanej metody terapeutycznej chorobotwórcze mutacje zostały naprawione z wydajnością do 29% z bardzo ograniczonym występowaniem mutacji typu indel (insercja -delecja) lub off-target. Uzyskana wydajność naprawcza edytorów adeniny była wystarczająca, aby u myszy poddanych terapii przywrócona została zarówno ekspresja białka RPE65 i jego aktywność niezbędna dla cyklu widzenia. Zaobserwowaliśmy również odzyskane  niemal na poziomie normalnym funkcje siatkówki i funkcje wzrokowe. Obiecujące wyniki naszych badań są przesłanką do dalszych testów terapii wrodzonych chorób siatkówki z wykorzystaniem edytorów adeniny oraz badań nad korygowaniem chorobotwórczych mutacji za pomocą niekanonicznych sekwencji PAM (ang. non-canonical protospacer-adjacent motifs).

Autorzy:

dr Andrzej Foik, e-mail: afoik@ichf.edu.pl & dr Anna Posłuszny, e-mail: aposluszny@ichf.edu.pl

Publikacja:

Restoration of visual function in adult mice with an inherited retinal disease via adenine base editing

Susie Suh, Elliot H. Choi, Henri Leinonen, Andrzej T. Foik, Gregory A. Newby, Wei-Hsi Yeh, Zhiqian Dong, Philip D. Kiser, David C. Lyon, David R. Liu & Krzysztof Palczewski

Abstract

Cytosine base editors and adenine base editors (ABEs) can correct point mutations predictably and independent of Cas9-induced double-stranded DNA breaks (which causes substantial indel formation) and homology-directed repair (which typically leads to low editing efficiency). Here, we show, in adult mice, that a subretinal injection of a lentivirus expressing an ABE and a single-guide RNA targeting a de novo nonsense mutation in the Rpe65 gene corrects the pathogenic mutation with up to 29% efficiency and with minimal formation of indel and off-target mutations, despite the absence of the canonical NGG sequence as a protospacer-adjacent motif. The ABE-treated mice displayed restored RPE65 expression and retinoid isomerase activity, and near-normal levels of retinal and visual functions. Our findings motivate the further testing of ABEs for the treatment of inherited retinal diseases and for the correction of pathological mutations with non-canonical protospacer-adjacent motifs.

Link to publication

https://doi.org/10.1038/s41551-020-00632-6

Jedną z metod wywołujących zmiany plastyczne w układzie wzrokowym jest jego powtarzalna stymulacja odpowiednimi bodźcami wzrokowymi. Wielokrotne prezentowanie danego typu bodźca wzrokowego może indukować zmiany w sieci neuronalnej i prowadzić do wzmocnienia odpowiedzi. Taki efekt został zaobserwowany i opisany na poziomie pierwszorzedowej kory wzrokowej (ang. primary visual cortex: V1). Celem przeprowadzonych przez nas badań było sprawdzenie wpływu powtarzalnego treningu wzrokowego, również na poziomie podkorowym,  w szczególności we wzgórku czworaczym górnym (ang. superior colliculus; SC), strukturą wchodzącą w skład pozakolankowatej drogi wzrokowej. W badaniu wykazano, iż trzygodzinny, bierny trening wzrokowy, oparty na wielokrotnie powtarzanych, prostych bodźcach wzrokowych  wywołuje wzmocnienie odpowiedzi wzrokowych zarówno na poziomie korowym, jak i we wzgórku czworaczym górnym u szczura. Kolejna część pracy dotyczyła wyjaśnienia powstałego wzmocnienia w SC, do którego informacja wzrokowa dostarczana jest zarówno z siatkówki jak i z warstwy 5 V1. Trening wzrokowy przeprowadzony z farmokologicznym wyciszeniem aktywności korowej nie wykazał wyciszenia odpowiedzi wzrokowych w SC, co świadczy o wystąpieniu plastyczności na tym poziomie przetwarzania wzrokowego niezależnie od V1.

Uzyskane wyniki mają nie tylko znaczenie poznawcze, ale także aplikacyjne, ponieważ  wskazały wzgórek czworaczy górny, jako możliwy cel treningów poprawiających efektywność procesu widzenia np. przy uszkodzeniach pierwszorzędowej kory wzrokowej.

Autorka:

dr Katarzyna Kordecka, e-mail: kkordecka@ichf.edu.pl

Publikacja:

Cortical Inactivation Does Not Block Response Enhancement in the Superior Colliculus

Katarzyna Kordecka, Andrzej T. Foik, Agnieszka Wierzbicka and Wioletta J. Waleszczyk

Abstract

Repetitive visual stimulation is successfully used in a study on the visual evoked potential (VEP) plasticity in the visual system in mammals. Practicing visual tasks or repeated exposure to sensory stimuli can induce neuronal network changes in the cortical circuits and improve the perception of these stimuli. However, little is known about the effect of visual training at the subcortical level. In the present study, we extend the knowledge showing positive results of this training in the rat’s Superior colliculus (SC). In electrophysiological experiments, we showed that a single training session lasting several hours induces a response enhancement both in the primary visual cortex (V1) and in the SC. Further, we tested if collicular responses will be enhanced without V1 input. For this reason, we inactivated the V1 by applying xylocaine solution onto the cortical surface during visual training. Our results revealed that SC’s response enhancement was present even without V1 inputs and showed no difference in amplitude comparing to VEPs enhancement while the V1 was active. These data suggest that the visual system plasticity and facilitation can develop independently but simultaneously in different parts of the visual system.

Link to publication

https://doi.org/10.3389/fnsys.2020.00059